碳酸酐酶SaCA及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了碳酸酐酶SaCA及其编码基因和应用。本发明专利技术提供的蛋白质，来源于盐螺旋菌(Salinispirillum sp.)，是一种碳酸酐酶，命名为SaCA蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明专利技术还保护SaCA蛋白作为碳酸酐酶的应用。本发明专利技术对于相关环境保护、医药领域等，具有重大的应用前景。具有重大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
碳酸酐酶SaCA及其编码基因和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉碳酸酐酶SaCA及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]随着社会经济的飞速发展，二氧化碳的排放问题日趋严重，而大气中二氧化碳含量的逐年增加是导致温室效应的主要原因，全球变暖越来越成为人们关注的焦点，因此，二氧化碳的捕集成为人们亟待解决的问题。研究人员提出了多种方案，不仅用于降低大气中二氧化碳的浓度，还用于二氧化碳的再利用。但是在这些方案中，二氧化碳的水合作用都是过程中的限速步骤。
[0003]碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase，EC 4.2.1.1)是催化二氧化碳与水、碳酸及氢质子之间可逆反应的金属酶。该酶最早在牛红细胞中被发现，随后，人们陆续从动物、植物、古细菌和真细菌中鉴定出不同种类的碳酸酐酶。到目前为止，人们将碳酸酐酶分为五类(α、β、γ、δ和ε)，其中α、β、γ三类酶存在于所有原核生物中，具有重要的生理功能。另外，有研究表明，碳酸酐酶在二氧化碳捕获技术中具有重要的作用，可大幅度提高二氧化碳的水和反应。因此，开发活性更高的碳酸酐酶新来源逐渐成为研究热点。本专利技术提供了新颖来源的碳酸酐酶SaCA及其编码基因和应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供碳酸酐酶SaCA及其编码基因和应用。
[0005]本专利技术提供的蛋白质，来源于盐螺旋菌(Salinispirillum sp.)，是一种碳酸酐酶，命名为SaCA蛋白，氨基酸序列如序列表中序列1所示。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有序列表中序列1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其突变体，只要其与前述氨基酸序列具有99％以上同源性，且具有碳酸酐酶功能，均属于本专利技术保护范围。具体的，所述改变包括氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和 /或替换。
[0006]SaCA蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。
[0007]优选的，所述基因的碱基序列如序列表中序列2所示，该基因序列来源于盐螺旋菌(Salinispirillum sp.)，由657个碱基组成。由于核苷酸序列的特殊性，任何序列表中序列2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本专利技术保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
[0008]含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物均属于本专利技术的保护范围。
[0009]本专利技术还保护SaCA蛋白作为碳酸酐酶的应用。应用SaCA蛋白作为碳酸酐酶时，采用的温度为20
‑
90℃，采用的pH为3
‑
11。应用SaCA蛋白作为碳酸酐酶时，采用的温度为55℃，采用的pH为6。
[0010]本专利技术提供的碳酸酐酶SaCA具有较高的酶活力，且反应温度宽泛，反应pH宽泛。
[0011]盐螺旋菌JH(Salinispirillum sp.JH)已于2020年7月29日保藏于中国典型培养
物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO: M 2020375。
[0012]本专利技术对于相关环境保护、医药领域等，具有重大的应用前景。
附图说明
[0013]图1为菌株JH的照片。
[0014]图2为菌株JH的系统发生树。
[0015]图3为SaCA蛋白溶液的电泳图。
[0016]图4为检测最适pH时的相对酶活结果。
[0017]图5为检测最适反应温度时的相对酶活结果。
[0018]图6为SaCA蛋白对CaCO3晶形影响的结果。
具体实施方式
[0019]以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0020]实施例1、盐螺旋菌JH的分离、鉴定和保藏
[0021]一、分离
[0022]样品取自内蒙古鄂尔多斯地区的一处碱湖，取碱湖样品50μL，加入碱湖滤液450 μL，吹打混匀得到10
‑1浓度样品，依次稀释得到10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5浓度的样品。取碱湖水样原液20μL、40μL及稀释得到的样品，涂布到LBH固体培养基中，在35℃恒温培养箱中培养3
‑
4d后，观察生长情况。
[0023]二、鉴定
[0024]将纯化后的菌株接种至LBH固体培养基中，于30℃恒温培养3d后，记录菌株的菌落颜色、凸起情况、边缘规则性、大小及透明度等。利用透射电子显微镜和倒置荧光显微镜观察菌株的形态、大小和胞外附属物等特征。利用革兰氏染色法对菌株进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。此外，采用穿刺接种法将菌株接种至半固体LBH培养基中，用以观察细菌的运动性和好氧性情况。
[0025]以LBH液体培养基作为基础培养基，分别添加0
‑
10.0％浓度(以1％为增量，w/v) 的NaCl，将菌株接种至上述培养基中，并于30℃下培养7d，空白对照组为不接种菌株的LBH培养基，利用分光光度计在600nm波长下检测菌体密度，从而确定菌株生长的最佳盐度；在pH 3.0
‑
11.0范围内(以1.0单位为间隔)，调节LBH液体培养基的pH值，将菌株接种至上述液体培养基中，空白对照组为不接种菌株的LBH培养基，使用分光光度计在600nm波长下检测菌体的生长密度，确定菌株生长的最适pH；将菌株接种至 LBH液体培养基中，分别在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、37℃、40℃、 45℃和50℃下培养7d，空白对照组为不接种菌株的LBH培养基，利用分光光度计在600 nm波长下检测菌体的生长密度，从而确定菌株的最适温度及温度生长范围；利用 Biolog GEN III鉴定板检测菌株对不同碳源的利用情况。
[0026]使用API 20NE和API 32GN试剂盒对菌株进行鉴定，如硝酸盐还原试验、亚硝酸盐
还原试验、酶活特性及碳源利用试验等。菌株Salinispirillum sp.JH和参考菌株 Salinispirillum marinum GCWy1
T
的结果见表1。
[0027]表1
[0028][0029][0030]利用基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，并利用PCR技术扩增菌株的16SrDNA序列。本实验采用的PCR体系为：4μL模板DNA、1μL引物27F、1μL引物1492R、 5μL 10
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Taq Buffer、4μL dNTP、0.8μL Taq DNA聚合酶、34.2μL灭菌超纯水。利用琼脂糖凝胶电泳对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种碳酸酐酶基因编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列由序列表中序列1所示。2.一种编码权利要求1所述蛋白质的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征是所述核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建国，李静，谭雯斐，辛文，王淼，李子一，徐莹莹，姜雪姣，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：