一种果胶裂解酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用，该果胶裂解酶突变体ΔPelG403为将野生型果胶裂解酶PelG403柔性区第129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突变为大分子量缬氨酸；其氨基酸序列和核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明专利技术提供的突变体酶在碱性条件下，酶活力和耐热性能有明显的提高，解决了野生型果胶裂解酶在碱性条件下催化活性低和热稳定性不足的问题，为利用该酶在棉麻加工、制浆造纸、工业废水处理等行业中的应用创造了良好条件。处理等行业中的应用创造了良好条件。处理等行业中的应用创造了良好条件。

【技术实现步骤摘要】
一种果胶裂解酶突变体
Δ
PelG403及其编码基因、制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学的
，更具体地，涉及一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]果胶裂解酶(Pectate lyase，简称Pel，EC 4.2.2.2)通过反式消去作用以随机方式切割果胶酸或果胶的α
‑
1，4
‑
糖苷键，生成C4‑
C5不饱和寡聚半乳糖醛酸；其最适pH一般在碱性范围，催化作用依赖于Ca
2+
。Starr和Moran于1962年在Erwinia carotovora和Bacillus polymyxa的培养物中首次发现果胶裂解酶；随后，在Penicillium sp.、Paenibacillus sp.和Psedomonas sp.等微生物资源中均发现了果胶裂解酶。
[0003]果胶裂解酶被广泛应用于许多领域，如造纸、咖啡和茶发酵、纺织和植物纤维加工、采油和处理工业废水等。
[0004]作为一种重要的清洁生产用酶，果胶裂解酶备受关注，其主要应用于纸浆漂白和纺织品的生物精炼等行业。酶解精炼方法能从根本上解决传统工艺存在的环境和能源等问题，在质量与环保方面具有传统工艺无法比拟的优点。果胶裂解酶的工业化应用主要取决于其酶活力的最适温度、最适pH、稳定温度和稳定pH等酶学性质。因此，从微生物菌种资源中发掘优良的果胶裂解酶，选择适合工业化生产应用的果胶裂解酶是关注的焦点之一。r/>[0005]果胶裂解酶在工业化应用过程中常会遇到高温环境，温度过高会破坏果胶酶蛋白中的盐桥、氢键、范德华力和疏水相互作用等非共价键，从而破坏果胶酶的空间结构，使其从折叠状态变为相对展开状态，果胶酶活力降低，甚至酶失活。据报道，目前大多数果胶裂解酶都来源于常温微生物，其在50℃下保温1h，基本全部失活。
[0006]随着分子生物学技术的发展，对现有果胶裂解酶进行分子改造，是获得高酶活力和耐高温优良酶种的有效手段之一。定点突变是基于果胶裂解酶已知或预测的结构信息及催化机理，对其结构与功能关系进行分析，推测出影响酶稳定性、催化活性等的主要位点，再对其关键位点进行修饰或替换；其具有突变率高、重复性好等优点，已被广泛用于酶性能的改良。
[0007]截至目前，尚未见到点突变改造果胶裂解酶的有关报道。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术提供了一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用。
[0009]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0010]本专利技术提供了一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403，其将柔性区第129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突变为大分子量缬氨酸。
[0011]具体地，在上述技术方案中，通过将位于第128
‑
137位的柔性区(无规卷曲和转角
区)中的第129位的氨基酸进行点突变，具体为在GenBank数据库中公布的pelG403基因序列(GenBank登录号：JX964998)的基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第129位丙氨酸，增加柔性区域的分子间作用力(范德华力等)，从而提高酶的耐热性。
[0012]进一步地，在上述技术方案中，所述果胶裂解酶突变体ΔPelG403的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]本专利技术还提供了编码所述果胶裂解酶突变体的基因ΔpelG403。
[0014]进一步地，在上述技术方案中，所述基因ΔpelG403的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015]本专利技术还提供了含有所述基因ΔpelG403的载体。
[0016]本专利技术还提供了含有所述基因ΔpelG403或所述载体的宿主细胞。
[0017]本专利技术还提供了含有所述基因ΔpelG403或所述载体的工程菌。
[0018]本专利技术又一方面还提供了所述基因ΔpelG403及其所编码的酶在降解棉麻胶质、造纸原料胶质和工业废水中果胶中的应用。
[0019]本专利技术再一方面还提供了生产所述果胶裂解酶突变体ΔPelG403的方法，包括：
[0020]将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列以能表达该酶的质粒为表达载体，以能表达该酶的菌株为表达宿主，实现SEQ ID NO.1所示的突变体基因的高效表达。
[0021]详细地，在上述技术方案中，将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因pelG403
A129V
的高效表达。
[0022]具体地，在上述技术方案中，所述果胶裂解酶基因pelG403来自一种麻类脱胶高效菌种Dickeya dadantii DCE
‑
01(保藏编号：CGMCC 5522，专利号：ZL201110410078.7)；所用的pET28a表达单元的启动子为常用的T7启动子，在T7启动子的作用下，突变体酶可以直接在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，完成胞内的可溶性表达。
[0023]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点：
[0024]本专利技术提供的突变体酶在碱性条件下，酶活力和耐热性能有明显的提高，解决了野生型果胶裂解酶在碱性条件下催化活性低和热稳定性不足的问题，为利用该酶在棉麻加工、制浆造纸、工业废水处理等行业中的应用创造了良好条件。
[0025]本专利技术通过比较野生酶PelG403和突变酶PelG403在碱性条件下对聚半乳糖醛酸钠的降解能力，结果表明：在pH为9.0的条件下，突变体酶PelG403
A129V
的比酶活为9820.5U/mg，为野生型PelG403的1.2倍；在50℃条件下保温2h，突变体酶PelG403
A129V
的剩余酶活力为1689.8U/mg，为野生型PelG403的4.7倍，即突变体酶在碱性条件下具有耐热和高酶活力的特性，预示着其在需高温碱性条件下的工业化生产中具有重要的应用前景。
附图说明
[0026]图1为本专利技术实施例中突变果胶裂解酶工程菌株的构建流程图；
[0027]图2为本专利技术实施例中重组质粒pET28a(+)
‑
pelG403的构建图谱；
[0028]图3为本专利技术实施例中定点突变的原理示意图；
[0029]图4为本专利技术实施例中野生型和突变型酶诱导表达的SDS
‑
PAGE图谱；
[0030]图5为本专利技术实施例中野生型和突变酶的稳定温度比较图。
具体实施方式
[0031]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。
[0032]应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403，其特征在于，将野生型果胶裂解酶PelG403柔性区第129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突变为大分子量缬氨酸。2.根据权利要求1所述的果胶裂解酶突变体ΔPelG403，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.编码权利要求2所述果胶裂解酶突变体的基因ΔpelG403。4.根据权利要求3所述的基因ΔpelG403，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.含有权利要求3或4所述基因ΔpelG403的载体。6.含有权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：成莉凤，彭源德，段盛文，冯湘沅，杨琦，郑科，彭正红，
申请(专利权)人：中国农业科学院麻类研究所，
类型：发明
国别省市：