用于检测松材线虫的gRNA、试剂盒及载体系统技术方案

本发明专利技术公开了一种用于检测松材线虫的gRNA，包含a)向导序列例如SEQ ID NO:1，其能够杂交至靶核苷酸序列，和b)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。本发明专利技术还公开了一种用于检测松材线虫的试剂盒，包含所述的gRNA或可转录为所述gRNA的DNA。本发明专利技术还公开了载体系统，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码所述gRNA的核苷酸片段。苷酸片段。苷酸片段。

【技术实现步骤摘要】
用于检测松材线虫的gRNA、试剂盒及载体系统


[0001]本专利技术涉及生物学检测
，具体涉及一种用于检测松材线虫的gRNA、试剂盒及载体系统。

技术介绍

[0002]松材线虫病，即松树萎蔫病是当今世界四大林木病害之一，被称为松树的“癌症”，而引起该病害的病原为松材线虫，在我国属于二级检疫对象。由于松材线虫肉眼不可直接观察，需要依靠专业的设备和人员，区分和鉴定松材线虫对检疫人员来说不仅任务繁重，而且是一个很大的挑战。对松材线虫进行有效识别，对于控制其危害，及时阻断其传播、扩散，起着至关重要的作用。目前，进出境口岸对松材线虫种类鉴定的主要手段是形态学观察、生化检测和分子生物学检测三大类，但是这些检测手段远远不能满足口岸部门对于松材线虫病高效、精准的检出要求。
[0003]目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。尽管现有技术中已有一些利用分子生物学手段对松材线虫进行特异性检测和鉴定，如：特异性引物PCR法、ITS
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PCR
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RFLP法和实时荧光定量PCR法等，这些方法具有快速、高效、低污染等优点，但是特异性引物PCR法和ITS
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PCR
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RFLP法需要电泳、染色、成像等多个步骤，而实时荧光定量PCR法所使用的仪器设备投入大，标记探针、试剂成本高，普适性较差，在检疫性鉴定应用方面存在缺陷，不能满足口岸和林间日常检测筛查的需要。
[0004]近年来，随着CRISPR基因编辑技术兴起，科学家基于RPA技术开发了以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术（SHERLOCK技术），还开发了以Cas12酶为核心的诊断技术。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要针对松材线虫的检测问题，提供一种用于检测松材线虫的crRNA、试剂盒及载体系统。
[0007]本专利技术的目的之一在于提供一种用于检测松材线虫的gRNA，包含a)向导序列为SEQ ID NO:1，其能够杂交至靶核苷酸序列，和b)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。
[0008]本专利技术的目的之二在于提供一种用于检测松材线虫的试剂盒，包含所述的gRNA或可转录为所述gRNA的DNA。
[0009]本专利技术的目的之三在于提供一种载体系统，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码所述gRNA的核苷酸片段。
[0010]本专利技术利用CRISPR/Cas技术实现松材线虫核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25℃～37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测
成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到2.8
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10
3 copies/μL，说明本专利技术方法敏感性较好。
附图说明
[0011]图1为本专利技术一实施例的敏感性检测结果图，其中，N表示阴性对照，Bx表示Bursaphelenchusxylophilus (松材线虫)，Bm表示Bursaphelenchusmucronatus (拟松材线虫)；图2为本专利技术一实施例的特异性检测结果图，其中，N1表示阴性对照，N2表示RAA扩增反应阴性，1表示2.8
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108copies/μL，2表示2.8
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107copies/μL，3表示2.8
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106copies/μL，4表示2.8
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105copies/μL，5表示2.8
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104copies/μL，6表示2.8
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103copies/μL，7表示2.8
´
102copies/μL。
具体实施方式
[0012]为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0013]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0014]如本文所用，术语“缓冲液”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH7~pH9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH（参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999）。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本专利技术的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液（PBS）、2
‑
氨基
‑
2羟甲基
‑
1,3
‑
丙二醇（TRIS）缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液（TBS）和TRIS/EDTA（TE）。
[0015]如本文所用，术语“扩增(ampIifying或amplification)”在“核酸”此用语的上下文中共同出现时，指产生多个拷贝的多核苷酸、或多核苷酸的部分，通常从少量的多核苷酸开始（例如，少至单个多核苷酸分子），其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增包括多种化学和酶促方法。在聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)或连接酶链反应(LCR)过程中从一个或几个拷贝的靶DNA或模板DNA分子产生多个DNA拷贝是扩增的形式。扩增不限于起始分子的严格复制。例如，使用逆转录RT
ꢀ‑
PCR从样品中有限量的RNA产生多个cDNA分子是扩增的形式。此外，在转录过程期间从单一DNA分子产生多个RNA分子也是扩增的形式。
[0016]如本文所用，术语“扩增引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，所述寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下），所述寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的，以用于扩增的最大效率，但可选地也可以是双链的。如果是双链的，则在用于制备本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测松材线虫的gRNA，其特征在于，包含a)向导序列为SEQ ID NO:1，其能够杂交至靶核苷酸序列，和b)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。2.用于检测松材线虫的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的gRNA或可转录为所述gRNA的DNA；还包含Cas核酸酶、信号报告分子、阳性对照和用于CRISPR检测体系的缓冲液中的至少一种。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述可转录为所述gRNA的DNA选自SEQ ID NO:10。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，Cas核酸酶选自Cas12核酸酶；所述与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO：2所示。5.根据权利要求2~4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述信号报告分子为信号报告单链DNA分子，所述信号报告单链DNA分子为具有信号报告功能的DNA分子，当其中的DNA序列被降解时，可报告阳性信号并被检测到。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包括试纸条，所述试纸条用以与所述信号报告单链DNA分子作用并显示所述信号报告单链DNA分子的信号结果。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述信号报告单链DNA分子的两端分别标记有第一标记物和第二标记物，如此，当所述信号报告单链DNA分子被CRISPR检测体系切割时，所述第一标记物与所述第二标记物分离；所述试剂盒还包含试剂条，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永林，武瑾，唐晨，尹康权，李学武，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：