一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，其特征在于：所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，与核苷酸序列为SEQIDNO：1所示的NtQPT2基因相比，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体具有c.229

【技术实现步骤摘要】
一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及遗传工程
，更具体地，涉及一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用。

技术介绍

[0002]烟碱是栽培烟草烟叶中重要的特征性化合物，占烟草总生物碱的95％左右。
[0003]目前，烟碱的合成途径已基本清晰，多个途径基因家族参与其中，例如PMT基因家族含有5个成员，QPT及MPO家族也都克隆获得了2个成员基因。除了途径基因外，烟碱合成受到多种转录因子基因的调控，如MYC2,ERF等。通过调控转录因子基因能够改变烟叶烟碱含量，如过表达MYC2a或者ERF115能够显著提高转基因烟草烟碱含量；抑制MYC2a的表达基因能够降低烟草烟碱含量。近年来，基因组编辑技术也应用于调控烟叶烟碱含量，比如敲除BBL家族多个基因获得了烟碱含量极低的烟草。
[0004]随着新型烟草制品市场的迅速扩展，烟草工业对不同烟碱梯度的烟叶需求日益增加，其中包括低烟碱含量烟草。因此，有必要研究降低烟叶烟碱含量的途径基因突变体及其应用以解决上述技术问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术主要目的在于获得降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，定位出该NtQPT2基因突变体的突变位点及突变类型。在此基础上，提供降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体的应用，用于降低烟草植株的烟叶烟碱含量。
[0006]因此，一方面，本专利技术提供了一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，其特征在于：所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtQPT2基因相比，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体具有c.229
‑
230insA突变，该突变使NtQPT2基因编码氨基酸序列在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。
[0007]本专利技术中，采用本领域通用表示法表示突变；c.229
‑
230insA突变表示NtQPT2基因序列229位增加1个A，造成移码突变，该突变能够显著降低烟草烟叶中烟碱含量。
[0008]进一步地，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]第二方面，本专利技术还提供一种NtQPT2基因突变体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0010]1、构建CRISPR/CAS9载体：
[0011](1)根据NtQPT2基因组序列设计靶位点，所述靶位点为：
[0012]PAM：SEQ ID NO：5；
[0013](2)根据步骤(1)中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物为：
[0014]P1：SEQ ID NO：6，
[0015]P2：SEQ ID NO：7；
[0016](3)根据步骤(1)中的靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物为：
[0017]NtQPT2
‑
SdF:SEQ ID NO：8，
[0018]NtQPT2
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SdR:SEQ ID NO：9，扩增长度为834bp；
[0019](4)根据步骤(2)中的得到的靶位点引物通过退火形成互补DNA oligo，得到dsDNA；
[0020](5)酶切pHSE401载体得到酶切产物，将所述酶切产物与步骤(4)中得到的dsDNA进行连接，得到连接产物；
[0021](6)将步骤(5)中得到的连接产物转化为大肠杆菌后进行菌落PCR检测，经PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，得到pHSE401
‑
QPT2载体；
[0022]所述菌落PCR检测时，所用引物设计为:
[0023]U6
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26p
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F：SEQ ID NO：10；
[0024]U6
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26p
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R：SEQ ID NO：11；上述引物对NtQPT2基因突变体检测的特异性好，准确性高；
[0025]测序时所用引物为：U6
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26p
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F:SEQ ID NO：10。
[0026]2、农杆菌转化
[0027](7)将农杆菌感受态细胞C58C1溶解后加入步骤(6)中得到的载体pHSE401
‑
QPT2进行农杆菌转化，得到含有目标载体的农杆菌克隆；
[0028]3、烟草转化
[0029](8)将步骤(7)中得到的含有目标载体的农杆菌克隆经划线接种后，在含有卡那霉素和利福平的LB培养基中进行扩繁，得到含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液；
[0030](9)取野生型烟草叶片利用乙醇和HgCl2处理后用无菌水进行冲洗，并吸去烟草叶片表面液体，得到无菌野生型烟草叶片；
[0031](10)将步骤(9)中得到的无菌野生型烟草叶片切成小片后，放入步骤(8)中得到的含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液中进行侵染，随后将烟草叶片转入分化培养基中进行培养，直至烟草叶片切口处逐渐形成愈伤组织并分化出芽；
[0032](11)待步骤(10)中的芽长至3～5cm时，切取芽，将切取的芽诱导生根，生根后移植于灭菌的营养土中，得到多株T0代转基因烟草幼苗；
[0033]4、测序筛选编辑材料
[0034](12)待步骤(11)中的T0代转基因烟草幼苗生长1周后，选取叶片提取DNA，经扩增后得扩增产物，扩增产物纯化后利用正向引物测序，经对测序结果进行分析，获得一株NtQPT2基因增加1个碱基A的编辑材料；种植该编辑材料得T1代植株，通过测序筛选该基因纯合突变单株并收种，获得具有NtQPT2纯合突变的T2代烟草种子。
[0035]第三方面，本专利技术提供NtQPT2基因突变体应用于降低烟叶烟碱的含量，所述NtQPT2基因突变体应用于降低烟草植株烟叶的烟碱含量。
[0036](13)对步骤(12)中得到的具有NtQPT2基因纯合突变的T2代烟草种子在温室进行种植，得到T2代烟草株系，利用YC/T383
‑
2010的方法检测植株烟叶烟碱含量。
[0037](14)含有突变序列的T2代烟草相比含有SEQ ID NO:1序列的烟草叶片烟碱含量显
著降低。
[0038]本专利技术的有益效果是：
[0039]1、本专利技术通过系统研究，首次提出了一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，本专利技术提出的降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体烟草植株，烟叶中烟碱含量比对照降低88％，使烟叶的烟碱含量显著降低。
[0040]2、本专利技术通过系统研究，通过构建CRISPR/CAS9载体，农杆菌转化、烟草转化及测序筛选编辑材料，获得NtQPT2基因序列229位增加1个A，造成移码突变的突变体，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，其特征在于：所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtQPT2基因相比，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体具有c.229
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230insA突变，该突变使NtQPT2基因编码氨基酸序列在突变位...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丙武，宋中邦，高玉龙，王亚辉，孔光辉，赵璐，隋学艺，张谊寒，焦芳婵，吴兴富，李永平，贺晓辉，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：