本发明专利技术公开了一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株及其应用，该菌株为从野生蛇足石杉内生细菌中分离获得，属于寡养单胞菌H1株，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术高效表达石杉碱甲的细菌菌株，作为治疗阿尔茨海默病的生物菌株，将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中，通过基因改造获得更多的优良性状，此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将会为生物合成工业化生产石杉碱甲，保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗阿尔茨海默病医药费用有着巨大意义。意义。意义。
【技术实现步骤摘要】
一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株及其应用
[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株，本专利技术还涉及该菌株的应用。
技术介绍
[0002]目前，乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物在阿尔茨海默病药物市场上处于主导地位。石杉碱甲为从民间草药蛇足石杉中分离获得的新型石松类单体生物碱，是一种强效的可逆性的胆碱酯酶抑制剂，具有多靶点作用，对乙酰胆碱酯酶的抑制作用为毒扁豆碱的3倍、加兰他敏的30倍，而且外周不良反应低，是治疗阿尔茨海默病临床优选药物之一。
[0003]源于天然植物的药物开发历史悠久且富有生命力，植物提取获得石杉碱甲为最简便方式，但植物提取获得石杉碱甲已面临植物资源匮乏瓶颈；化学合成生产石杉碱甲仍是研发重要途径之一，但合成步骤繁琐、代价昂贵，很难获得纯光学活性的合成物。
[0004]因此利用从野生蛇足石杉内生细菌中筛选分离具有产石杉碱甲能力的菌株对于治疗阿尔茨海默病和保护植物资源意义重大。虽然目前国内外已有对产石杉碱甲菌株进行开发和研究，但寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)具备产石杉碱甲功能却鲜有报道。对已获得的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)H1株可通过生物技术改造菌株为获得石杉碱甲工业化生产提供新的菌种资源。同时，通过对其菌株产石杉碱甲机理的研究，利用合成生物学使其获得更优良稳定的产石杉碱甲性状和能力。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株，解决植物提取获得石杉碱甲面临植物资源匮乏瓶颈、化学合成步骤繁琐、代价昂贵，很难获得纯光学活性的合成物的问题。
[0006]本专利技术的另一个目的是提供一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株作为治疗阿尔茨海默病的功能菌株在生物合成制药方面的应用。
[0007]本专利技术所采用的第一种技术方案是：一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株，菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.21399，保藏日期：2020年12月18日。
[0008]本专利技术所采用的第一种技术方案的特点还在于，菌株从野生蛇足石杉(Huperzia serrata)内生细菌中分离获得，属于寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)H1株，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]细菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为：
[0010](1)培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL；
[0011](2)培养条件：25℃，220r/min；
[0012](3)装液量：250mL锥形瓶，装液量为100mL；
[0013](4)培养时间：2天。
[0014]菌株的实验室保存条件为：(1)菌株每次在培养基固体斜面传代后，生长时间为24h；(2)保存菌种条件为4℃，12h后再将其放置
‑
25℃冰箱中进行保存。
[0015]本专利技术所采用的第二种技术方案是：一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株作为治疗阿尔茨海默病的功能菌株在生物合成制药方面的应用，菌株从野生蛇足石杉(Huperzia serrata)内生细菌中分离获得，属于寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)H1株，保藏编号：CGMCC No.21399。
[0016]本专利技术所采用的第三种技术方案是：一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株的应用，通过转基因、诱变育种对细菌菌株进行基因改造，以获得表达效率更高、遗传稳定性更好的系列菌株。
[0017]本专利技术的有益效果是，本专利技术一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株，作为治疗阿尔茨海默病的生物菌株，将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中，通过基因改造获得更多的优良性状，此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将会为生物合成工业化生产石杉碱甲，保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗阿尔茨海默病医药费用有着巨大意义。
附图说明
[0018]图1是本专利技术高效表达石杉碱甲的细菌菌株产石杉碱甲能力的高效液相检测图；
[0019]图2为石杉碱甲标准品的高效液相检测图；
[0020]图3为琼脂糖凝胶电泳检测本专利技术细菌菌株中所抽提DNA的PCR产物电泳图；
[0021]图4为本专利技术高效表达石杉碱甲的细菌菌株形态图。
具体实施方式
[0022]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。
[0023]本专利技术一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科，石杉属)内生细菌中分离获得，属于寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)H1株，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。
[0024]该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位中国普通微生物菌种保藏中心保藏。
[0025]生物材料保藏信息：
[0026]名称：寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)H1株
[0027]保藏编号：CGMCC No.21399
[0028]保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
[0029]保藏时间：2020年12月18日
[0030]地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0031](一)本专利技术高效表达石杉碱甲菌株的分离方法如下：
[0032]将新鲜蛇足石杉植株用自来水冲洗后，先用浓度为75％酒精进行表面消毒30s，无菌水冲洗4次，接着用10％NaClO浸泡5min，无菌水冲洗4次，最后再用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗4次后，用无菌刀片将茎切成0.5cm大小，叶片切成0.3cm
×
0.3cm小块，接种到含有15μg/mL链霉素和1mg/mL脱氧胆酸钠的固体培养基上，倒置于25℃培养箱中进行暗培养。为了检验上述表面消毒是否彻底，同时把在消毒过程中最后一次冲洗组织块的无菌
水涂布在培养基上进行培养。2d后，无菌操作法挑取在茎段和叶片切口上所长出的菌丝，平板划线法转接到新鲜的培养基平板上，重复上述操作直到得到纯化的内生菌为止。
[0033](二)高效表达石杉碱甲菌株发酵液制备：将分离得到的纯化内生菌分别接入装有100mL液体培养基的250mL锥形瓶(每个菌株接3瓶)，置于摇床上，25℃、220r/min振荡培养2d，设置3个重复，内生细菌在振荡培养2d后，发酵液于10000r/min离心15min。
[0034](三)高效表达石杉碱甲菌株产物分析测定：取发酵液离心后的上清液500mL，采用二氯甲烷和乙醚提取方法提取石杉碱甲，用0.01mol/l盐酸溶解定容至5mL，用高效液相法测定发酵上清液产石杉碱甲的含量。高效液相(HPLC)色谱柱为Agilent Cl8柱(4.60mm
×
250mm，5μm)；色谱条件为：流动相为磷酸盐缓冲液...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株，其特征在于，所述菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.21399。2.根据权利要求1所述的一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株，其特征在于，所述菌株从野生蛇足石杉(Huperzia serrata)内生细菌中分离获得，属于寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)H1株，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.根据权利要求2所述的一种高效表达石杉碱甲的寡养单胞菌H1株，其特征在于，所述细菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为：(1)培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL；(2)培养条件：25℃，220r/min；(3)装液量：250mL锥形瓶，装液量为100mL；(4)培养时间：2天。4....
【专利技术属性】
技术研发人员：韩文霞，韩忠文，李伟泽，王琳，张寒，孙静，李小峰，贾敏，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：
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