一种RNA酶解液的预处理方法技术

本发明专利技术公开一种RNA酶解液的预处理方法，包括：RNA溶解液：总体积6L，其中RNA用量2％，固体酶用量5％和硫酸锌用量0.5％；RNA反应：分别取两组3L的RNA溶解液，再分别进行RNA反应，反应温度为70

【技术实现步骤摘要】
一种RNA酶解液的预处理方法


[0001]本专利技术涉及核苷酸产品
，具体涉及一种RNA酶解液的预处理方法。

技术介绍

[0002]将核糖核酸(RNA)通过核酸酶P1或磷酸二酯酶酶解反应，再经过阴离子交换树脂层析分离再分别浓缩、结晶、干燥，可以制得腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)和尿苷酸(UMP)等4种单一核苷酸产品。
[0003]在应用阴离子交换树脂层析分离时，由于RNA和酶等含有色素、蛋白质等杂质，会使树脂色泽变深，交换性能降低。一般树脂在使用10批后，会使原来浅黄色的树脂变成褐色，上样交换核苷酸容量下降10％；树脂在使用20批后，树脂变成深褐色，上样交换核苷酸容量下降20％；树脂在使用30批后，树脂成为黑褐色，上样交换核苷酸容量下降30％以上。并且分离效果越来越差。如不采取措施，必须更换新树脂。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种RNA酶解液的预处理方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种RNA酶解液的预处理方法，其创新点在于，包括以下步骤：
[0006]S1、RNA溶解液：总体积6L，其中RNA用量2％，固体酶用量5％和硫酸锌用量0.5％；
[0007]S2、RNA反应：分别取两组3L的RNA溶解液，再分别进行RNA反应，反应温度为70
‑
72℃，反应时间3h，然后在反应时间2.5h和3h取样，并进行HPLC检测反应转化率；
[0008]S3、RNA反应液预处理：
[0009]1)板框过滤：将其中一组3L的RNA溶解液通过硅藻土过滤，得到过滤液；
[0010]2)微滤：将板框过滤液通过0.25um或0.5um微滤膜进行微滤，得到滤液；
[0011]3)超滤：滤液进超滤机，设定超滤机的膜分子量分别为3000、6000、10000、20000，泵压力为0.2
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0.6Mpa进行超滤，且每个膜分子量分别超滤20
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50min，同时在超滤时间范围内多次随机取样超滤液和排废液；
[0012]4)检测：检测过滤液、超滤液和排废液的紫外吸收波长A250、A260、A280、A430，并计算浓度C；
[0013]5)阳树脂：超滤液经过阳离子交换树脂，通过流速SV1；
[0014]RNA反应液中主要存在的杂质主要包括：大分子变性的蛋白质、颗粒性杂质、色素、可溶性蛋白、钙、镁、锌离子等；RNA反应液预处理方法：1)板框过滤和微滤，主要去除变性的蛋白质和颗粒物质。2)超滤：主要是去掉可溶性蛋白质和部分色素分子。3)阳离子交换树脂：主要去掉钙、镁、锌等离子；
[0015]S4、RNA上样：将超滤液和RNA反应液分别上样，漏出浓度C≥0.4g/L，且上样液浓度和漏出液浓度的比值2≥1，判定为上样漏穿，记录上样量和上样体积。
[0016]进一步的，所述微滤的孔径为0.25um或0.5um微滤。
[0017]进一步的，所述超滤的流量为100
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200ml/min。
[0018]本专利技术有益效果为：
[0019]1、本专利技术通过板框过滤、微滤、超滤、阳树脂等一系列预处理组合，可以去除RNA和酶等原料中含有的大分子蛋白质、颗粒杂质、色素、可溶性蛋白质、钙、镁、锌离子等杂质，减少了吸附到阴离子交换树脂上的杂质，有效的保护了阴离子交换树脂，从而延长了阴离子交换树脂的寿命。
[0020]2、本专利技术RNA反应液超滤后杂质的减少使4种核苷酸在树脂上的分布更加均匀，在洗脱的过程中，更好的出现一个个层析带，更加有利于4种核苷酸的分离效果。
[0021]3、本专利技术超滤去掉了RNA反应液中的大分子的杂质，在上样过程中减少了大分子物质吸附在阴离子交换树脂上，从而有更多的核苷酸吸附在阴离子交换树脂上，所以增加了核苷酸的交换容量。
附图说明
[0022]图1为本专利技术中RNA溶解液的HPLC检测反应转化率分析报告一；
[0023]图2为本专利技术中RNA溶解液的HPLC检测反应转化率分析报告二。
具体实施方式
[0024]下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。
[0025]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0026]本专利技术经过大量实验，最终应用板框过滤、微滤和超滤等方法解决了上述问题。RNA酶解液一般要升温至85
‑
90℃，使酶变性，然后冷却至45℃以下板框过滤，去除颗粒性和变性蛋白等杂质，此时溶液中还存在色素、可溶性蛋白等杂质。本专利技术的做法是将此板框过滤清夜先通过0.25um或0.5um微滤，然后再经过超滤，分别使用3000、6000、10000、20000分子量的超滤膜超滤，最后经过阳树脂去除钙、镁、锌等离子，得到杂质和色素量少的RNA反应液。
[0027]对两组RNA溶解液进行HPLC检测反应转化率的分析报告见图1和图2，且从图1和图2中可以看出，通过HPLC检测，RNA溶解液反应转化率2.5h为67.71％，3h为69.15％，说明反应过程正常。
[0028]实施例1
[0029]取反应液001，见表一：
[0030]名称A430浓度C吸附量备注反应液0011.08332.751体积3L
[0031]表一
[0032]反应液001分别在(分子量为3000D、泵压力0.2Mpa)、(分子量为6000D、泵压力0.2Mpa)、(分子量为10000D、泵压力0.2Mpa)、(分子量为20000D、泵压力0.2Mpa)进行实现，并得到以下数据，见表二：
[0033]分子量泵压力A430浓度C时间吸附量交换吸附增加量分离度3000D0.2Mpa0.39025.2950min1.1818％提高6000D0.2Mpa0.45528.3542min1.1313％提高10000D0.2Mpa0.62229.5830min1.088％提高20000D0.2Mpa0.92130.1224min1.055％无变化
[0034]表二
[0035]综上所述，通过不同分子量的超滤膜3000D、6000D、10000D、20000D分子量的超滤膜可以看出：3000D的超滤膜进行超滤3L RNA溶解液，并进行吸附测定，可以得出结论：通过超滤可以去掉色素，去除率达64％，可以增加吸附量，增加约18％，去色素和增加吸附性能能力较好；6000D的超滤膜进行超滤3L RNA溶解液，并进行吸附测定，可以得出结论：通过超滤可以去掉色素，去除率达56％，可以增加吸附量，增加约13％；10000D的超滤膜进行超滤3L RNA溶解液，并进行吸附测定，可以得出结论：通过超滤可以去掉色素，去除率达43％，可以增加吸附量，增加约8％；2000D的超滤膜进行超本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA酶解液的预处理方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、RNA溶解液：总体积6L，其中RNA用量2％，固体酶用量5％和硫酸锌用量0.5％；S2、RNA反应：分别取两组3L的RNA溶解液，再分别进行RNA反应，反应温度为70
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72℃，反应时间3h，然后在反应时间2.5h和3h取样，并进行HPLC检测反应转化率；S3、RNA反应液预处理：1)板框过滤：将其中一组3L的RNA溶解液通过硅藻土过滤，得到过滤液；2)微滤：将板框过滤液通过0.25um或0.5um微滤膜进行微滤，得到滤液；3)超滤：滤液进超滤机，设定超滤机的膜分子量分别为3000、6000、10000、20000，泵压力为0.2
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0.6Mpa进行超滤，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈修足，徐浩，邱蔚然，武琳，陈红燕，
申请(专利权)人：南通秋之友生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：