以外泌体为载体的miRNA给药系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种以外泌体为载体的miRNA给药系统及其应用。本发明专利技术的研究证明分选基序G

【技术实现步骤摘要】
以外泌体为载体的miRNA给药系统及其应用
技术背景
[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种以外泌体为载体的miRNA给药系统及其应用。
技术介绍

[0002][0003]外泌体(Exosomes)是细胞分泌到胞外的一种囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)，其大小为30
‑
150nm，具有双层膜结构和茶托状形态，存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中；外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，参与细胞间的分子传递。
[0004]外泌体(Exosome)是由大多数细胞分泌的小膜泡。内泡由细胞室向内出芽形成，称为多泡体(MVB)。当MVB与质膜融合时，这些内部的囊泡被释放为外泌体，外泌体可以将DNA、RNA和蛋白质转移到远处的受体细胞，并影响细胞行为和生理的各个方面。但是如何将外泌体作为药物载体，把特定的DNA、RNA、蛋白质或者小分子药物表达在外泌体中是目前有待解决的。
[0005]目前已经使用各种方法(例如电穿孔、挤压和超声处理)用于将治疗剂加载到EVs中。然而，电穿孔的方式条件苛刻，效率低下并且破坏了外泌体双层膜结构；挤压和超声处理等方式则不适用于DNA、RNA、蛋白质等大分子药物。
[0006]本专利技术旨在通过基因改造miRNA,使得miRNA具有特定的序列，并在外泌体中富集，进而在外泌体中特异表达特定miRNA目的，实现以外泌体为载体的miRNA给药系统。

技术实现思路

[0007]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种hnRNPA2B1特异性识别的分选基序，所述分选基序包括如下核心序列：G
‑
X
‑
Y
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G，其中X为G、A、U，Y为A、U；
[0008]在本专利技术的具体实施方案中，所述分选基序包括如下序列：M
‑
G
‑
X
‑
Y
‑
G，其中，M为A、U；X为G、A、U，Y为A、U。
[0009]在本专利技术的具体实施方案中，所述分选基序包括如下序列：N
‑
M
‑
G
‑
X
‑
Y
‑
G，其中，M为A、U；N为A、C、G、U；X为G、A、U，Y为A、U。
[0010]在本专利技术的具体实施方案中，所述分选基序包括如下序列：N
‑
M
‑
G
‑
X
‑
Y
‑
G，其中，M为A、C、G、U；N为A、C、G、U；X为G、A、U，Y为A、U。
[0011]在本专利技术的具体实施方案中，所述分选基序包括如下序列：L
‑
N
‑
M
‑
G
‑
X
‑
Y
‑
G，其中，M为A、C、G、U；N为A、C、G、U；L为A、C、G、U；X为G、A、U，Y为A、U。
[0012]根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了一种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包括前面所述的分选基序。
[0013]进一步，本专利技术的RNA多核苷酸包括一个或多个前面所述的分选基序，并且可包含多于一个相同的前面所述的分选基序或不同的前面所述的分选基序。跟更为详细地，可以将基本上无限数量前面所述的分选基序和不同前面所述的分选基序的组合引入任何单个多核苷酸中，以用于实现增强的膜结构递送的潜力。
[0014]在一些实施方案中，包含前面所述的分选基序的RNA多核苷酸包括天然存在的RNA也包括非天然存在的RNA。
[0015]所述天然存在的RNA包括编码RNA和非编码RNA。非编码RNA包括miRNA、ncRNA。在本专利技术的具体实施方案中，所述非编码RNA是miRNA。编码RNA是mRNA。
[0016]所述非天然存在的RNA包括所述分选基序与天然存在的RNA连接形成的产物、含有所述分选基序的天然存在的RNA与非天然存在的功能性多核苷酸连接形成的产物、所述分选基序与非天然存在的功能性多核苷酸连接形成的产物。
[0017]进一步，所述功能性多核苷酸包括短发夹RNA(shRNA)、或短干扰RNA(siRNA)、成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)指导RNA。
[0018]进一步，前面所述的分选基序连接于天然存在的RNA或功能性多核苷酸的末端，所述连接可以是直接连接或间接连接。所述间接连接可以通过IRES连接。
[0019]在本专利技术的具体实施方案中，所述RNA多核苷酸序列如SEQ ID NO:1
‑
6所示。
[0020]根据本专利技术的又一个方面，本专利技术提供了一种DNA多核苷酸，所述DNA多核苷酸表达前面所述的RNA多核苷酸。
[0021]在本专利技术的具体实施方案中，所述DNA多核苷酸序列是能够产生SEQ ID NO:1
‑
6所示的RNA序列的shRNA对应的DNA。
[0022]优选地，所述DNA多核苷酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13
‑
18所示。
[0023]根据本专利技术的又一个方面，本专利技术提供了一种核酸衍生物，所述核酸衍生物包含前面所述的RNA多核苷酸或前面所述的DNA多核苷酸。
[0024]进一步，所述核酸衍生物还包括前面所述的RNA多核苷酸或前面所述的DNA多核苷酸的修饰部分。
[0025]所述修饰可以改善核苷酸的功能、生物利用度、稳定性等。合适的修饰及其制备方法是本领域周知的。本文公开的多核苷酸可以包含一种或多种修饰，或非天然存在的元件或核酸。在优选的方面，所述核酸包含2
’‑
O
‑
甲基类似物。在某些情况下，所述核酸包含3'硫代磷酸酯核苷酸间键或其他锁核酸(LNA)。在某些情况下，所述核酸包含ARCA帽。可以使用其他化学修饰的核酸或核苷酸，例如2'
‑
位糖修饰、2'
‑
O
‑
甲基化、2'
‑
氟修饰、2'NH2修饰、5
‑
位嘧啶修饰、8
‑
位嘌呤修饰、环外胺的修饰、4
‑
硫尿苷的取代、5
‑
溴或5
‑
碘
‑
尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、非常规的碱基配对组合(如异胞苷和异胍)等。修饰还可以包括3'和5'修饰，例如加帽。例如，所述核酸可以被聚乙二醇化。
[0026]根据本专利技术的又一个方面，本专利技术提供了含有前面所述的RNA多核苷酸、前面所述的DNA多核苷酸、或前面所述的核酸衍生物的载体。
[0027]本专利技术的“载体”是用作将外来遗传物质转移到细胞中的寡核苷酸分子(DNA或RNA)。载体可以是用于在细胞中表达外源遗传物质的表达载体。这样的载体可以包括启动子序列，其与编码要表达的基因序列的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种hnRNPA2B1特异性识别的分选基序，所述分选基序包括如下核心序列：G
‑
X
‑
Y
‑
G，其中X为G、A、U，Y为A、U；优选地，所述分选基序包括如下序列：M
‑
G
‑
X
‑
Y
‑
G，其中，M为A、U；X为G、A、U，Y为A、U；优选地，所述分选基序包括如下序列：N
‑
M
‑
G
‑
X
‑
Y
‑
G，其中，M为A、U；N为A、C、G、U；X为G、A、U，Y为A、U；优选地，所述分选基序包括如下序列：N
‑
M
‑
G
‑
X
‑
Y
‑
G，其中，M为A、C、G、U；N为A、C、G、U；X为G、A、U，Y为A、U；优选地，所述分选基序包括如下序列：L
‑
N
‑
M
‑
G
‑
X
‑
Y
‑
G，其中，M为A、C、G、U；N为A、C、G、U；L为A、C、G、U；X为G、A、U，Y为A、U。2.一种RNA多核苷酸，其特征在于，所述RNA多核苷酸包括权利要求1所述的分选基序；优选地，所述RNA多核苷酸包括天然存在的RNA，非天然存在的RNA；优选地，所述非天然存在的RNA包括所述分选基序与天然存在的RNA连接形成的产物、含有所述分选基序的天然存在的RNA与非天然存在的功能性多核苷酸连接形成的产物、所述分选基序与非天然存在的功能性多核苷酸连接形成的产物；优选地，所述天然存在的RNA包括编码RNA、非编码RNA；优选地，所述编码RNA是mRNA；优选地，所述非编码RNA是miRNA；优选地，所述功能性多核苷酸包括shRNA、siRNA、gRNA；优选地，所述分选基序连接于所述天然存在的RNA或所述功能性多核苷酸的末端；优选地，所述连接是直接连接或间接连接；优选地，所述RNA多核苷酸序列如SEQ ID NO:1
‑
6所示。3.一种DNA多核苷酸，其特征在于，所述DNA多核苷酸表达权利要求2所述的RNA多核苷酸；优选地，所述DNA多核苷酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13
‑
18所示。4.一种核酸衍生物，其特征在于，所述核酸衍生物包含权利要求2所述的RNA多核苷酸或权利要求3所述的DNA多核苷酸；所述核酸衍生物还包括权利要求2所述的RNA多核苷酸或权利要求3所述的DNA多核苷酸的修饰部分。5.含有权利要求2所述的RNA多核苷酸、权利要求3所述的DNA多核苷酸、或权利要求4所述的核酸衍生物的载体。6.一种含有权利要求2所述的RNA多核苷酸、权利要求3所述的DNA多核苷酸、权利要求4所述的核酸衍生物或权利要求5所述的载体的微生物；优选地，所述微生物是病毒；优选地，所述病毒是慢病毒。7.一种含有权利要求2所述的RNA多核苷酸、权利要求3所述的DNA多核苷酸、权利要求4所述的核酸衍生物或权利要求5所述的载体的细胞；优选地，所述细胞表达hnRNPA2B1或其功能类似物和权利要求2所述的RNA多核苷酸或权利要求4所述的核酸衍生物；优选地，所述细胞是真核细胞；优选地，所述细胞是哺乳动物细胞；优选地，所述细胞是间充质干细胞；优选地，所述hnRNPA2B1功能类似物的序列与hnRNPA2B1序列同源性至少50％以上；优选地，所述细胞分泌膜结构；优选地，所述膜结构包括外泌体、囊泡、微囊泡、微颗粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴理达，顾雨春，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技珠海横琴新区有限公司，
类型：发明
国别省市：