用于测定氨甲环酸含量的方法及试剂盒技术

本申请涉及化合物含量测定方法，具体涉及用于测定氨甲环酸含量的方法及试剂盒。该方法包括：将样品中的氨甲环酸与衍生化试剂进行衍生化反应，得到氨甲环酸衍生化物；使用超高效液相色谱法或超高效液相色谱

【技术实现步骤摘要】
用于测定氨甲环酸含量的方法及试剂盒


[0001]本申请涉及化合物含量测定方法，具体涉及采用超高效液相色谱法或超高效液相色谱
‑
质谱联用法测定氨甲环酸含量的方法，以及用于该测定方法的试剂盒。

技术介绍

[0002]氨甲环酸(Tranexamic Acid)，又名传明酸、凝血酸、止血环酸，分子式为C8H
15
NO2，分子量为157.21，化学名称为反
‑4‑
氨甲基环已烷甲酸。
[0003][0004]纤溶现象与机体在生理或病理状态下的纤维蛋白分解、血管通透性增加等有关，亦与纤溶引起的机体反应、各种出血症状及变态反应等的发生发展和治愈相关。氨甲环酸可抑制这种纤溶酶的作用，而表现出止血、抗变态反应、消炎效果。
[0005]氨甲环酸在治疗浓度(5
‑
10μg/mL)时血浆蛋白结合率极低(约3％)，肾、肝的药物浓度高于血液，而在其他脏器中的浓度比血液浓度低，其给药量的40
‑
70％经肾脏代谢，以原型经尿排出。
[0006]随着我国老年人口占比逐年增加，出现肾功能下降的人群也在扩大，而这类人群也是心血管方面疾病的高发人群。肾功能下降或不全可能会使血药浓度升高，而氨甲环酸可能使这类患者有血栓稳定化的倾向。因此对于有肾功能下降或不全的患者来说，开展氨甲环酸血药浓度定量监测是非常有必要的。
[0007]在文献Qi Chang,Ophelia Q.P.Yin,Moses S.S.Liquid chromatography
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tandem mass spectrometry method for the determination of tranexamic acid in human plasma.Clinical Trial[J]，J.Chromatogr.B 805(2004)275
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2802001,51(3):189
‑
196中，使用LC
‑
MS/MS建立方法，等度洗脱，色谱柱为Xtrra
TM MS C
18 Column，采用甲基多巴为内标，血浆用量200μL，使用高氯酸除去蛋白质提取氨甲环酸，经高速离心后取上清用于进样，进样时间5min。该方法的主要缺陷为：高氯酸具有腐蚀性，进入质谱后，对质谱造成损害，影响质谱的灵敏度，不适用于大批量样本检测；高氯酸属于易制爆化学品，其购买、保存均不方便，使用过程也存在危险性，对方法使用的单位或人员有严格要求，不适合普及；单针样品进样时间为5.5min，进样效率低；内标选择不合理。
[0008]在文献《氨甲环酸胶囊的药物动力学及生物等效性》，杨丽君、王峰、刘晓磊、朱运贵，中国医药工业杂志[J]，2008,39(4)：273
‑
275中，使用LC
‑
MS建立方法，等度洗脱，色谱柱为Thermo C
18 Column，采用甲氧苄啶为内标，血浆用量300μL，使用乙腈除去蛋白质提取氨甲环酸，经高速离心后取上清用于进样，进样时间5.5min。该方法的主要缺陷为：使用的质谱检测器为单四极杆，不能做MS/MS模式，无法区分血浆中具有相同质荷比的源内性物质的干扰，且灵敏度比较差；内标物选择不合理，氨甲环酸极性大，而内标极性恰好相反，从色谱
图中也可以看出两者色谱保留行相差较大；流动相盐浓度过高(30mM)，一般要求盐浓度不超过10mM；因为高浓度盐对质谱的离子化效率有抑制作用，而且对色谱柱的使用寿命有较大影响；另外，液相高压泵头内存在高压析盐现象，析出的细小盐粒，容易磨损密封垫，造成漏液等故障现象；单针样品进样时间为5.5min，进样效率低。
[0009]在文献Nicolas Fabresse,Fanta Fall,Isabelle Etting,Philippe Devillier,Jean
‑
Claude Alvarez,Stanislas Grassin
‑
Delyle.LC
–
MS/MS determination of tranexamic acid in human plasma afterphospholipid clean
‑
up[J],Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 141(2017)149
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156中，使用LC
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MS/MS建立方法，梯度洗脱，色谱柱为Accucore Urea HILIC column，采用4
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氨基环己烷甲酸为内标，血浆用量50μL，使用Ludox AS
‑
40(硅溶胶)、氯化镧除磷脂后，再用甲醇除去蛋白质提取氨甲环酸，经高速离心后取上清用于进样。该方法的主要缺陷为：生物样品分析方法的相关法规要求，定量下限应能满足测定3
‑
5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出C
max
的1/10
‑
1/20的药物浓度；氨甲环酸在治疗浓度(5
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10μg/mL)时血浆蛋白结合率极低(约3％)；药代动力学研究时，使用的药物剂量(250mg)更低，最大血药浓度约2.5μg/mL；该文献定量下限浓度为1μg/mL，明显偏高；样品前处理使用多种试剂，先后使用Ludox AS
‑
40(硅溶胶)、氯化镧进行反应来除去血浆中磷脂，再使用甲醇除去血浆中的蛋白，涉及多个环节，操作过程繁琐、耗时，影响工作效率。
[0010]目前需要建立简便、快速、准确、可靠定量氨甲环酸在样品尤其是复杂基质样品中含量的方法，并开发用于该方法的试剂盒，使其适用于检测人血浆或其他液体形式复杂基质中氨甲环酸的含量测定。

技术实现思路

[0011]本申请的一个或多个实施方式提供了测定氨甲环酸含量的方法，包括：
[0012]将样品中的氨甲环酸与衍生化试剂进行衍生化反应，得到氨甲环酸衍生化物；
[0013]使用超高效液相色谱法或超高效液相色谱
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质谱联用法测定样品中的氨甲环酸的含量。
[0014]在一个或多个实施方式中，超高效液相色谱
‑
质谱联用法包括采用一级质谱法或二级质谱法进行检测。
[0015]在一个或多个实施方式中，所述样品为包含复杂基质的样品。
[0016]在一个或多个实施方式中，所述样品为包含液体复杂基质的样品。
[0017]在一个或多个实施方式中，所述样品为血浆样品。
[0018]在一个或多个实施方式中，所述样品为人血浆样品。
[0019]在一个或多个实施方式中，其中在测定所述样品中氨甲环酸的含量前，使所述样品与蛋白质沉淀剂进行沉淀反应。
[0020]在一个或多个实施方式中，将所述衍生化反应和沉淀反应同时进行。
[0021]在一个或多个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.测定氨甲环酸含量的方法，包括：将样品中的氨甲环酸与衍生化试剂进行衍生化反应，得到氨甲环酸衍生化物；使用超高效液相色谱法或超高效液相色谱
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质谱联用法测定样品中的氨甲环酸的含量。2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品为包含复杂基质的样品；优选地，所述样品为包含液体复杂基质的样品；更优选地，所述样品为血浆样品；更优选地，所述样品为人血浆样品。3.如权利要求1所述的方法，其中在测定所述样品中氨甲环酸的含量前，使所述样品与蛋白质沉淀剂进行沉淀反应；优选地，将所述衍生化反应和沉淀反应同时进行；更优选地，所述蛋白质沉淀剂为乙腈和/或甲醇。4.如权利要求1所述的方法，其中所述衍生化试剂为C2
‑
C10酸酐；优选地，所述衍生化试剂为丙酸酐或乙酸酐；更优选地，所述衍生化试剂为1％
‑
15％丙酸酐的乙腈溶液；更优选地，所述衍生化试剂为10％丙酸酐的乙腈溶液。5.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中应用外标法或内标法测定样品中的氨甲环酸的含量；优选地，在所述内标法中使用的内标物为氨甲环酸
‑
13
C2,
15
N；更优选地，所述内标物为氨甲环酸
‑
13
C2,
15
N的乙腈溶液；更优选地，内标物的浓度为1
‑
100ng/mL；更优选地，内标物的浓度为50ng/mL。6.如权利要求5所述的方法，其中使用超高效液相色谱
‑
质谱联用法、应用内标法测定样品中的氨甲环酸的含量；优选地，将所述样品中的氨甲环酸和内标物同时进行衍生化反应；更优选地，其中将所述样品中的氨甲环酸和内标物的衍生化反应与沉淀反应同时进行。7.如权利要求1所述的方法，其中所述衍生化反应为将氨甲环酸与衍生化试剂混合；优选地混合并振荡；优选地，混合后离心取上清液；更优选地，将所述上清液稀释；更优选地，使用甲酸水溶液稀释；更优选地，所述甲酸水溶液的浓度为0.1％
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1％；更优选地，所述甲酸水溶液的浓度为0.3％。8.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁琪，唐智，周玲，欧阳冬生，高阳，姜茜，胡斌，万柯驿，
申请(专利权)人：长沙都正生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：