用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针制造技术

本发明专利技术涉及用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针。提供了用于检测和定量核酸的方法和组合物。在某些实施方案中，方法涉及采用包含与报告基团相连之非天然核苷酸的引物或探针。通过互补探针或引物的聚合来检测靶核酸，所述互补探针或引物整合与淬灭基团连接的同源非天然核苷酸。的同源非天然核苷酸。的同源非天然核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针
[0001]本申请是针对申请号为201710604440.1、专利技术名称为“用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针”的中国专利申请的分案申请，该申请是2017年7月21日提交的分案申请。本申请所针对的申请是申请号为201480051337.3、专利技术名称为“用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针”的中国专利申请的分案申请，该母案申请是2014年8月11日提交的PCT国际申请PCT/US2014/050514进入中国国家阶段的申请。
[0002]本申请要求于2013年8月9日提交的美国临时申请序列No.61/864.128的优先权权益，通过引用将其全部内容并入本文。
[0003]专利技术背景
1.

[0004]本专利技术一般性涉及分子生物学领域。更特别地，其涉及核酸的检测。
2.
技术介绍

[0005]聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、基因克隆、亲子鉴定和DNA计算。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点(end
‑
point)或者平台期进行DNA检测，这使得难以对起始模板进行定量。实时PCR或动态PCR通过记录反应过程中的扩增子浓度，从而提高了终点PCR分析的能力。最通常通过与被扩增的靶标有关的荧光信号的改变来记录扩增子浓度。实时PCR相对于终点检测的优势还在于，由于其在封闭的系统中进行，因此限制了污染。其它优势包括更高的灵敏度、动态范围、速度和需要较少的过程。
[0006]在实时PCR检测方法中已经采用了几种测定化学。这些测定化学包括采用双链DNA结合染料、双标记的寡核苷酸，例如发夹引物和发夹探针。然而，目前实时PCR的一个缺陷在于其受限的多重性(multiplexing)能力。目前的实时PCR技术采用在溶液中游离的报告荧光染料。在多重反应中，该设计必须在每个测定中采用光谱不同的荧光色素。例如，设计来检测4个靶序列的多重反应将需要能够通过光谱不同来区分4个不同的、游离漂浮的荧光色素的仪器，这还不包括对照。这些要求不仅限制了实际的多重能力，而且增加了成本，其原因在于这样的设备通常需要多个发射源、检测器和滤器。目前的实时PCR技术的多重能力为大约1
‑
6重(plex)。

技术实现思路

[0007]本专利技术涉及用于DNA扩增和检测的系统和方法。特别是，本专利技术提供的系统和方法极大地提高了实时核酸扩增(例如经PCR)的多重能力。
[0008]在一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)将所述样品与第一引物组接触，所述第一引物组包含第一引物，所述第一引物从5
’
至3
’
包含，
(i)报告基团(reporter)；(ii)具有已知熔链点(melt point)的发夹；(iii)聚合酶延伸
‑
阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列；(b)用所述第一引物组扩增所述靶核酸，其中在用淬灭基团(quencher)标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第一引物上报告基团的信号改变(例如信号淬灭)来检测所述靶核酸分子的存在。
[0009]因此，在一个更特定的实施方案中，提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其包括：(a)将所述样品与至少第一和第二引物组接触，每组引物包含第一引物，所述第一引物从5
’
至3
’
包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸
‑
阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列，其中所述第一和第二引物组的报告基团相同，并且其中所述第一和第二引物组包含具有可区分熔链点的发夹；(b)用所述第一和第二引物组扩增所述靶核酸(以获得扩增产物)，其中在用淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一和第二引物组之第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第一或第二引物组之第一引物上的报告基团的信号改变来检测靶核酸分子的存在；以及(d)改变所述样品的温度并确定对应于所述报告基团未淬灭时的熔链点或熔链峰(melt peak)，来确定第一靶核酸分子、第二靶核酸分子或两者的存在是否导致所述报告基团的信号淬灭，由此检测所述第一和第二靶核酸分子的一个或两者的存在(例如，基于所述第一和第二引物组的发夹的可区分熔链点)。
[0010]在某些方面，该实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接在所述第一引物5
’
端的荧光团。因此，在一些情况下，信号的改变可以是荧光信号的降低。在另一方面，检测所述第一引物上报告基团的信号改变还包括与扩增产物杂交，所述扩增产物包含报告基团和淬灭基团(例如暗淬灭基团(dark quencher))。
[0011]在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或者降低至低于)所述样品中一个或更多个引物之发夹的熔链点。当存在两个或更多个引物组的情况下，改变样品的温度可以包括将样品温度从低于第一和第二引物组之两个第一引物的发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹的熔链点的温度。
[0012]实施方案的某些方面涉及采用至少一个非天然核苷酸。在一些方面，非天然核苷酸为异碱基(isobase)，例如异鸟嘌呤(isoG)或异胞嘧啶(isoC)。在该方面，淬灭基团标记的非天然核苷酸为同源isoC(或isoG)。在另一些方面，第一和/或第二引物的至少一个在靶特异性序列中包含至少一个非天然核苷酸。例如，在某些方面，靶特异性序列中的非天然核苷酸调节序列特异性退火，由此增强了核苷酸的序列特异性扩增的引物
‑
模板杂交(参见例如PCT公开WO2011/052078，通过引用并入本文)。
[0013]在另一方面，所述实施方案的方法还包括：(a)将样品与第二(或其它)引物组接触，所述第二(或其它)引物组包含第一引物，所述第一引物从5
’
至3
’
包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸
‑
阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与第二(或其它)靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其
包含与所述第二(或其它)靶核酸第二链上的区域互补的序列；(b)用第二引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测第一和第二靶核酸中的一个或两者之存在的方法，其包括：(a)将样品至少与第一和第二靶特异性引物
‑
探针组接触，每个引物
‑
探针组包含：(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5
’
标签序列；(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域；和(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，其中所述第一和第二测定探针的一个经报告基团标记，而另一个经淬灭基团标记；以及其中所述第一和第二测定探针具有已知熔链点，并且其中所述第一引物
‑
探针组的第一和第二测定探针的熔链点可与所述第二引物
‑
探针组的第一和第二测定探针的熔链点区分开；(b)在适合于所述靶核酸杂交的条件下，将样品与所述引物
‑
探针组的靶特异性引物和靶特异性探针一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶对杂交的靶特异性探针进行切割，以将所述标签序列从所述靶特异性探针释放；(d)将释放的标签序列与所述第一测定探针杂交；(e)沿着所述第一测定探针延伸杂交的标签序列，并切割与所述第一测定探针杂交的所述第二测定探针；(f)通过检测所述第一和/或第二引物
‑
探针组的第一或第二测定探针上报告基团信号的未淬灭来检测靶核酸；以及(g)通过对所述第一和第二测定探针进行熔链曲线分析来确定所述第一靶特异性引物
‑
探针组、第二靶特异性引物
‑
探针组或两者的第二测定探针是否被切割，其中对应于特定第一和第二测定探针组之熔链峰的减少或消失指示所述第二测定探针被切割，并且指示所述第一或第二靶核酸的存在。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一引物
‑
探针组的报告基团与所述第二引物
‑
探针组的报告基团相同。3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一测定探针的第二区域至少包含第一非天然核苷酸，所述第二测定探针至少包含至少与所述第一测定探针的第一非天然核苷酸碱基配对的第一非天然核苷酸。4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一或第二测定探针的非天然核苷酸为isoG，另一个为isoC。5.如权利要求3所述的方法，其中所述第一测定探针的第二区域包含2至5个非天然核苷酸，所述第二测定探针包含与所述第一测定探针的所述2至5个非天然核苷酸碱基配对的2至5个非天然核苷酸。6.至少检测第一靶核酸之存在的方法，其包括：(a)将样品与第一靶特异性引物
‑
探针组接触，所述引物
‑
探针组包含：(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；
(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5
’
标签序列；(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域；和(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，其中所述第一和第二测定探针的一个标记有报告基团，另一个标记有淬灭基团；(b)在适合于所述靶核酸杂交的条件下，将所述样品与所述靶特异性引物和靶特异性探针一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶对杂交的靶特异性探针进行切割，以将标签序列从所述靶特异性探针释放；(d)将释放的标签序列与所述第一测定探针杂交；(e)沿着所述第一测定探针延伸杂交的标签序列，并切割与所述第一测定探针杂交的第二测定探针；以及(f)通过检测所述第一或第二测定探针上报告基团信号的未淬灭，来至少检测第一靶核酸。7.如权利要求6所述的方法，其中报告基团为荧光团。8.如权利要求7所述的方法，其中信号的未淬灭为荧光信号的提高。9.如权利要求6所述的方法，其中引物
‑
探针组之组分(i)
‑
(iv)的一个或更多个分别与所述样品接触。10.如权利要求6所述的方法，其中所述第一和第二测定探针具有已知熔链点，并且其中检测所述报告基团的信号未淬灭包括当所述样品温度改变时检测所述报告基团的信号改变。11.如权利要求10所述的方法，其中检测所述报告基团的信号改变包括检测对应于测定探针的熔链峰的减少或消除，这指示所述第二测定探针被切割，并指示靶核酸的存在。12.如权利要求10所述的方法，其中检测所述报告基团的信号改变包括当提高所述样品的温度高于标签序列和抗标签报告基团的熔链点时，检测所述报告基团的信号改变。13.如权利要求6所述的方法，其中所述第一测定探针的第二区域至少包含第一非天然核苷酸，所述第二测定探针至少包含至少与所述第一测定探针的第一非天然核苷酸碱基配对的第一非天然核苷酸。14.如权利要求13所述的方法，其中所述第一或第二测定探针的非天然核苷酸为isoG，另一个为isoC。15.如权利要求6所述的方法，其中所述第一测定探针标记有报告基团，所述第二测定探针标记有淬灭基团。16.如权利要求6所述的方法，其中所述靶特异性探针包含与所述靶核酸第一链上的第二区域互补的序列，所述序列的长度为6至60个核苷酸。17.如权利要求6所述的方法，其中所述靶特异性探针的5
’
标签序列的长度为6至50个核苷酸。18.如权利要求6所述的方法，其中所述第一靶特异性引物
‑
探针组的第一测定探针的第二区域包含聚合酶延伸
‑
阻断修饰，并且其中检测报告基团的信号改变包括检测对应于
测定探针的熔链峰的温度迁移，这指示所述第二测定探针被切割，并指示所述靶核酸的存在。19.如权利要求6所述的方法，其还包括至少检测第二靶核酸，所述方法包括：(a)将样品与第二靶特异性引物

【专利技术属性】
技术研发人员：道格，
申请(专利权)人：卢米耐克斯公司，
类型：发明
国别省市：