一种CHA明胶支架制造技术

本发明专利技术公开了一种CHA明胶支架，通过以下方法制备所得：将5 g来自牛骨的B型明胶溶入50 ml含有二水合柠檬酸钠的蒸馏水中，作为分散剂；明胶完全溶胀后，加入0.37 g氢氧化钙，并使用磁力搅拌器在37℃下以200 rpm的转速混合30分钟；将0.24 g磷酸稀释在50 ml蒸馏水中，并将所得的磷酸溶液滴定到明胶水凝胶溶液中，15分钟；合成成熟度持续3小时，并定期控制pH，最终将pH调节至7.4；称取Gel

【技术实现步骤摘要】
一种CHA明胶支架


[0001]本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种CHA明胶支架。

技术介绍

[0002]在以往的研究中，对于骨缺损我们往往采用不同类型支架（如各种类型的金属、凝胶、复合材料支架）并且搭载种子细胞(以骨髓间充质干细胞应用最为广泛)的方法，但存在着支架内种子细胞的再生及分化不良导致其治疗效果不是很理想等问题。为了让支架内的种子细胞可以更好的分化生长使其发挥更好的功效，我们计划通过一层屏障膜的覆盖使得支架内的骨髓间充质干细胞在早期修复过程中获得一定优势，从而能够更好地分化为成骨细胞，促进成骨，同时支架也能对胶原屏障起到一定的支持作用。

技术实现思路

[0003]为解决上述问题，本专利技术提供了一种CHA明胶支架。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种CHA明胶支架，通过以下方法制备所得：S1、将5 g来自牛骨的B型明胶（Nitta Gelatin Inc.）溶入50 ml含有二水合柠檬酸钠（C6H5Na3O7·
2H2O，默克公司，德国达姆施塔特）的蒸馏水中，作为分散剂；S2、明胶完全溶胀后，加入0.37 g氢氧化钙（Ca（OH）2）（日本东京和光市），并使用磁力搅拌器在37℃下以200 rpm的转速混合30分钟；S3、将0.24 g磷酸（H3PO4，Merck）稀释在50 ml蒸馏水中，并将所得的磷酸溶液滴定到明胶水凝胶溶液中，约15分钟；合成成熟度持续3小时，并定期控制pH，最终将pH调节至7.4；S4、称取Gel
‐
CHA05溶液 9.5g，倒入8
×
8 cm2的溶液培养皿内，在4℃的冰箱（MPR
‑
213F Sanyo，日本大阪）中干燥8
‑
12h，然后置于真空烘箱（VO
‑
400，Memmert GmbH + Co。，德国施瓦巴赫，德国）内，在142℃加热72小时，以诱导支架的交联形成，低温环氧乙烷中进行气体灭菌。
[0005]本专利技术具有以下有益效果：通过将胶原膜与羟基磷灰石
‑
明胶支架相结合，既提升了胶原膜的机械强度，避免了二次手术，又能依赖胶原膜的选择透过性的功能使得支架内的骨髓间充质干细胞在早期修复过程中获得一定优势，从而能够更好地分化为成骨细胞，促进成骨。目前已有相关研究证验证了胶原膜具有促进骨髓间充质干细胞成骨的能力，本研究创新性地采用了羟基磷灰石
‑
明胶支架搭载骨髓间充质干细胞并与胶原膜结合的方式，既提高了胶原膜的机械性能，又能促进成骨。
附图说明
[0006]图1为Gel
‑
CHA00和Gel
‑
CHA05支架的FTIR光谱；
图中：A：Gel
‑
CHA00 ；B：Gel
‑
CHA05。
[0007]图2为支架材料与胶原膜相结合治疗骨缺损示意图。
[0008]图3为骨髓间充质干细胞在光镜下的照片。
[0009]图4为流式细胞术鉴定表面抗原。
[0010]图5为电镜下骨髓间充质干细胞的形态。
[0011]图6为各组骨缺损修复处组织的 HE 染色和 Masson 染色示意图。
[0012]图中：A，B：空白对照组 ；C，D：胶原膜组；E，F：胶原膜加支架组。
具体实施方式
[0013]下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。
[0014]膜的检测一:XRD机、FTIR光谱仪采用RINT 2500V XRD机 、傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪进行样品的检测，图1显示了Gel
‑
CHA00和Gel
‑
CHA05支架的FTIR光谱。对于Gel
‑
CHA05，在波长为 3424cm
‑
处出现的吸收峰与
‑
OH 基团的伸缩振动有关；1638
‑
1655cm
‑
处的酰胺Ⅱ带是 C=O 键的伸缩振动引起的。在 1034cm
‑
处有PO4
‑
基团 V3 的特征吸收峰，在 565cm
‑
和 605cm
‑
处出现 HA 中的磷酸根 P
‑
O 键的弯曲振动引起的吸收峰，表明复合材料表面有 HA的存在。在 1334 cm
‑
处出现吸收峰表明 HA
‑
Gel 复合物中 Gel 的羧基与 HA 的钙离子之间有 Ca
‑
COO 化学键形成因此，FTIR光谱证实，在明胶系统内部涉及化学湿法沉淀的Gel
‑
CHA05支架合成过程中，CHA完全形成。
[0015]二、有无细胞毒性细胞接种
①
将支架放置在六孔板中，并在细胞接种之前浸入4 ml体积的完全生长培养基中1小时，以实现最佳溶胀；
②
1小时后将细胞接种到2个实验组中：在无支架的培养基和含Gel
‑
CHA05的培养基中进行细胞培养，每个孔板含1
×
105个细胞；
③
每两天收集一次培养基用于进一步分析，并替换为新鲜培养基。
[0016]膜的生理特性：1：细胞相容性（MTT/CCK
‑
8）
①
将纳米纤维膜切成直径为15 mm的圆形，厚度为0.043 mm，并放入24孔板中，以在细胞接种之前在UV辐射下灭菌6 h;
②
将MSC（2
×
104个细胞/孔）接种到膜上进行细胞增殖和粘附测定;
③
培养3、7和14天后，通过3
‑
（4,5
‑
二甲基噻唑
‑2‑
基）
‑
2,5
‑
二苯基溴化四溴化铵（MTT）法（n= 3）测试细胞增殖并通过酶标仪，波长为490 nm。
[0017]2、检测细胞凋亡：
①
将1
×
105MSCs /孔接种到6孔板的纳米纤维膜上；
②
然后培养3天，然后用Annexin V
‑
EGFP / PI细胞凋亡试剂盒（KeyGEN BioTECH，南京，中国）分析（n= 3）。在流式细胞仪（BD FACSCalibur，美国）下评估结果；3、通过SEM观察培养的MSC的形态。
[0018]实时PCR通过定量聚合酶链反应（qPCR）确定Runt相关转录因子2（RUNX2，胶原蛋白α1（COL1A1）和骨桥蛋白（OPN）的成骨基因表达。使用甘油醛3
‑
磷酸脱氢酶（GAPDH）作为管家基因。简要地，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CHA明胶支架，其特征在于：通过以下方法制备所得：S1、将5 g来自牛骨的B型明胶溶入50 ml含有二水合柠檬酸钠的蒸馏水中，作为分散剂；S2、明胶完全溶胀后，加入0.37 g氢氧化钙，并使用磁力搅拌器在37℃下以200 rpm的转速混合30分钟；S3、将0.24 g磷酸稀释在50 ml蒸馏水中，并将所得的磷酸溶液滴定到明胶水凝胶溶液中， 15分钟；...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨佩，李沂阳，田润，王坤正，孔宁，刘冠志，关焕帅，李哲，魏启鲁，焦鸣，严峻腾，李越，刘晓辉，王朝，邢方泽，雷雨田，李志强，蒋武强，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第二附属医院，
类型：发明
国别省市：