用于检测食管癌的组合物及其试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术提供了用于检测食管癌的组合物及其试剂盒和应用。本发明专利技术提供的食管癌基因甲基化检测试剂盒以癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标DNA甲基化异常作为检测对象，可通过检测食管脱落细胞、外周血的基因甲基化状态，实现无创检测，同时采用数字PCR技术，可在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号进行统计学分析，彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，提高实验结果在批内和批间的稳定性，实现对起始样品的绝对定量，同时提高核酸检测方法的灵敏度，有效减少假阴性的出现，从而实现食管癌的早期筛查。管癌的早期筛查。管癌的早期筛查。

【技术实现步骤摘要】
用于检测食管癌的组合物及其试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种组合物及其在疾病检测中的用途，具体地涉及一种用于检测食管的组合物及其相应的试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]食管癌是一种从下咽到食管胃结合部之间食管上皮来源的消化道恶性肿瘤，是人类常见的十大恶性肿瘤之一，其死亡率居所有癌症第六位。我国是食管癌的高发地区，每年平均病死约15万人。研究发现，食管癌早期患者的五年生存率可达到95％以上，但多数食管癌患者的早期症状不典型，若出现进行性吞咽困难一般已属中晚期，而中晚期患者预后差，五年生存率较低，总生存率不超过15％，因此建立食管癌预警和早期筛查的方法，对食管癌的防治非常重要，早发现、早诊断、早治疗、早手术是防控食管癌的有效手段。
[0003]目前用于食道癌的检测和筛查方法有影像学检测技术、组织活检、肿瘤血清标识物检测等。这此方法要么设备成本高，操作技术要求强，检测成本高；要么侵入性强，不适于早癌的筛查；要么灵敏度很低，无法满足临床检测需要。因此有必要开发灵敏、特异的新型食道癌标识物和检测技术，提高食道癌早癌检出率、改善食道癌治疗效果、降低食道癌死亡率。
[0004]表观遗传学是近年来肿瘤研究的热点领域，DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。多种研究证明食管癌病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，其中大多数异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，高甲基化往往导致抑癌基因的转录沉默。DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
[0005]目前关于DNA甲基化的主要检测方法众多，从应用上大致可以分成两类：全基因组甲基化分析和特异位点甲基化检测。全基因组甲基化分析检测成本较高，常作为一种高通量的筛选发现目标基因的手段。特异位点甲基化检测方法有联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化荧光定量法(MethyLight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法等，限制性内切酶分析法只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，甲基化特异性PCR法基于普通PCR及电泳分析操作繁琐且易造成样本污染，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法对仪器要求较高，需要带高分辨率熔解(HRM)模块的荧光定量PCR仪，甲基化荧光定量法基于其较高的通量和敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，在DNA甲基化的检测中应用较为广泛，但基于荧光定量PCR的甲基化荧光定量法需要额外制备标准曲线才能对样本核酸定量，同时在检测低浓度的核酸样本时灵敏度不足，容易造成假阴性从而延误癌症的早诊早治时机，给DNA甲基化的检测带来了
技术挑战。与荧光定量PCR相比，数字PCR具有更高的检测灵敏度和准确性，数字PCR方法通过将核酸样本稀释，遵循泊松分布规律，将其分配至微反应单元中，在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号进行统计学分析，彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，提高了实验结果在批内和批间的稳定性，实现对起始样品的绝对定量，同时提高核酸检测方法的灵敏度，有效减少假阴性的出现。
[0006]有鉴于此，本专利技术通过筛选食管癌相关甲基化基因，建立基于数字PCR的食管癌基因甲基化检测方法，期望获取具有更高灵敏度、特异性和准确性的检测试剂，实现食管癌的早期筛查与诊断。

技术实现思路

[0007]为达到上述目的，本专利技术提供用于检测食管癌的组合物及其试剂盒和应用，本专利技术通过TCGA数据库筛选出PLCD1、ZNF154等2个基因甲基化检测位点，并通过建立基于数字PCR的食管癌基因甲基化检测，得到灵敏度更高的食管癌检测试剂盒，实现食管癌的早期筛查与诊断，利于食管癌的早诊早治。
[0008]本专利技术第一方面提供食管癌基因甲基化检测位点，所述的基因甲基化检测位点包括PLCD1和/或ZNF154。
[0009]本专利技术第二方面提供食管癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，包括以下1)和/或2)所示的核酸序列组合：
[0010]1)PLCD1甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合1、引物探针组合2中的一种，其中所述引物探针组合1包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物以及如SEQ ID NO.3所示的荧光探针，所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5所示的下游引物以及如SEQ ID NO.6所示的荧光探针；
[0011]2)ZNF154甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4、引物探针组合6中的一种，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.10所示的上游引物、如SEQ ID NO.11所示的下游引物以及如SEQ ID NO.12所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如SEQ ID NO.16所示的上游引物、如SEQ ID NO.17所示的下游引物以及如SEQ ID NO.18所示的荧光探针。
[0012]在本专利技术一实施例中，所述的食管癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，还包括检测内参基因GAPDH的PCR引物及探针，所述引物包括如SEQ ID NO.19所示的上游引物、如SEQ ID NO.20所示的下游引物，所述探针包括如SEQ ID NO.21所示的荧光探针。
[0013]在本专利技术一实施例中，所述荧光探针的5
’
端包含有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。
[0014]在本专利技术一实施例中，所述荧光探针的3
’
端包含有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种。
[0015]在本专利技术一优选实施例中，所述荧光淬灭基团为MGB。
[0016]本专利技术第三方面提供食管癌基因甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括如本专利技术第二方面所述的PCR引物探针组合，还包括阳性质控品以及阴性质控品。
[0017]在本专利技术一实施例中，所述阳性质控品为人食管癌细胞系DNA。
[0018]在本专利技术一实施例中，所述阴性质控品为人外周血白细胞DNA。
[0019]在本专利技术一实施例中，所述食管癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-1μM PCR引物、0.1-1μM探针。
[0020]在本专利技术一优选实施例中，所述食管癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-0.5μM PCR引物、0.1-0.5μM探针。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于食管癌基因甲基化检测位点，其特征在于，所述的基因甲基化检测位点包括PLCD1和/或ZNF154。2.用于食管癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，包括以下1)和/或2)所示的核酸序列组合：1)PLCD1甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合1、引物探针组合2中的一种，其中所述引物探针组合1包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物以及如SEQ ID NO.3所示的荧光探针，所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5所示的下游引物以及如SEQ ID NO.6所示的荧光探针；2)ZNF154甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4、引物探针组合6中的一种，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.10所示的上游引物、如SEQ ID NO.11所示的下游引物以及如SEQ ID NO.12所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如SEQ ID NO.16所示的上游引物、如SEQ ID NO.17所示的下游引物以及如SEQ ID NO.18所示的荧光探针。3.如权利要求2所述的用于食管癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，还包括检测内参基因GAPDH的PCR引物及探针，其中，所述引物包括如SEQ ID NO.19所示的上游引物、如SEQ ID NO.20所示的下游引物，所述探针包括如SEQ ID NO.21所示的荧光探针。4.如权利要求2或权利要求3所述的用于食管癌基因甲基化检测的PCR引物探针组...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵琦，
申请(专利权)人：安徽达健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：