一种快速鉴定毛黄堇药材的Dual-SNP-TaqMan荧光探针制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针及其制备和快速鉴定毛黄堇药材的方法。所述新型荧光探针为扩增阻滞-Taqman双重特异位点荧光探针，所述荧光探针使用的上引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，下引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。新型荧光探针采用了扩增阻滞和Taqman的结合技术，可同时对2个位点进行检测，更多的避免试验中出现假阳性，以保证检测的准确性；所提供的快速鉴定毛黄堇药材的检测试剂盒可稳定有效准确的鉴定出毛黄堇药材，从而有利于毛黄堇药材质量控制，以保障用药安全、有效。有效。有效。

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定毛黄堇药材的Dual-SNP-TaqMan荧光探针


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速鉴定毛黄堇药材的Dual-SNP-TaqMan荧光探针及其制备方法和试剂盒以及快速鉴定毛黄堇药材的方法。

技术介绍

[0002]紫堇属是罂粟科最大的属，被认为是分类最复杂的植物类群之一。生长地区复杂的地质结构和当地气候和环境的多变，加之在系统发育上经历典型的网状进化和激烈的分化，紫堇属表现出高水平的形态和生境多样性，其叶片、地下块茎、果实、种子和花部特征都非常的复杂多变，严重影响精准的物种鉴定和系统分类。毛黄堇药材为紫堇属石生黄堇组植物，在重庆民间作为治疗肝炎、肝硬化的特效草药，也可祛瘀止痛，凉血止血。由于生长在石灰岩崖壁缝隙中，资源量极小，市场价格高达2000～3000元/公斤，加之入药以干燥，药材鉴定尤为困难。受利益驱使，常有不法商贩以同属近缘种石生黄堇、紫堇、黄堇、小花黄堇等干燥全草混伪毛黄堇药材药材在市场中大量涌现，出售的毛黄堇药材混伪极为严重。大量研究表明，不同基源药材毛黄堇药材生物碱含量差异较大，而毛黄堇药材不仅在保肝方面，也在心血管疾病与中枢神经系统有重要作用，药材使用的混乱给用药安全埋下巨大隐患。迫切需要建立准确、高效的鉴定方法，应用于毛黄堇药材质量控制，以保障用药安全、有效。
[0003]准确的物种鉴定是生物多样性研究和保护的前提，也是几乎所有植物学研究的基础。然而，由于毛黄堇药材样品收集的难度，复杂的形态特征，混伪品(紫堇属)较多，传统形态分类有极大的局限，故可使用分子生物学方法鉴定毛黄堇药材及混伪品。核糖体RNA内转录间隔区(ITS)，具有较高的变异率和相对高的物种鉴别能力，已被提议作为种子植物的核心条码。.然而，没有一个单独的序列在植物中具有通用性。不同的序列往往在不同的植物类群中鉴定能力不一样，且对于大类群的紫堇属植物来说，常规的分子鉴定方法较为繁琐，因此，有必寻找一种快速鉴定毛黄堇药材的正品的分子技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一在于提供一种快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针及其制备方法，所述快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针可同时对多个位点进行检测，避免试验中出现假阳性，以保证检测的准确性。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用以下方案：
[0006]所述新型荧光探针为扩增阻滞-Taqman双重特异位点(Dual-SNP-TaqMan)荧光探针，所述荧光探针使用的上引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，下引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0007]进一步，所述扩增阻滞-Taqman双重特异位点荧光探针的上下引物根据毛黄堇药材的第一个特异性SNP位点设计，所述第一个特异性SNP位点为毛黄堇药材ITS序列525位C-T的变异。
[0008]进一步，所述扩增阻滞-Taqman双重特异位点荧光探针的Taqman探针根据毛黄堇
药材的第二个特异性SNP位点设计，所述第二个特异性SNP位点为毛黄堇药材ITS序列555位的A-G变异。
[0009]进一步，所述的快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针的方法在于以下步骤：
[0010]1)提取DNA；
[0011]2)PCR扩增ITS序列并测序分析特异性SNP变异位点；
[0012]3)根据变异位点设计新型荧光探针的上下引物和探针。
[0013]进一步，步骤2)使用的PCR扩增的上引物的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，下引物的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0014]进一步，步骤2)分析变异位点采用HMMer模型，去除保守的5.8S rRNA序列。
[0015]进一步，第一个特异性SNP变异位点为毛黄堇药材ITS序列525位C-T的变异，第二个特异性SNP位点为毛黄堇药材ITS序列555位的A-G变异。
[0016]具体的，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，作为第三代分子标记，只有2种等位型，具有二态性和等位基因性，因具备数量多、分布频密、遗传稳定性高、易于分型检测等特征，被广泛应用于分子诊断、临床检验、遗传疾病和新药研发等方面。荧光探针技术是基于实时荧光定量PCR建立的一种核酸定量检测技术，常用于基因表达分析、遗传疾病诊断、病原鉴定。近年来，有学者将其应用到中药材快速鉴定中。与传统PCR电泳或测序法比较，荧光探针检测具有灵敏度高、操作简单、快速等优点，且避免了染料荧光PCR法假阳性和荧光本底信号干扰等问题。
[0017]TaqMan荧光探针是使用最普遍的荧光探针。其原理是利用Taq酶的5-3
’
外切酶活性，通过一对引物和一条探针(5
’
端标记有荧光集团，3
’
标记有荧光淬灭基团)对特异性片段或特异位点进行检测，从而实现对物种的鉴定。阻滞扩增反应依赖反应中Taq DNA聚合酶缺少3
′※5′
外切酶活性的特性,对于3
′
末端错配的引物,以低于正常末端配对引物的速度延伸,当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时,3
′
末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸,反应终止，从而表明模板DNA没有与引物3
′
末端相应的碱基；反正得到特异长度的扩增条带,表明3
′
末端碱基匹配.
[0018]TaqMan荧光探针鉴定的准确性依赖于片段和位点的特异性，不同植物的DNA条形码可能不能提供特异性的SNP位点，出现分段位点，而在鉴定中，更多信息位点的运用有助于提高准确率，因此，同时对多个位点进行检测，避免试验中出现假阳性，以保证试验准确性十分重要。目前对多位点的检测常用多重探针设计，及根据每个位点分别设计一条特异性探针同时进行检测。理想的鉴定技术应同时满足准确、快速、廉价的要求。多重探针的设计意味着成本的大幅增加，显然多重射击不是理想的选择，如何通过一条探针对多个位点进行检测，是TaqMan荧光探针改进的方向。
[0019]为了提高了探针特异性和准确性，且不增加成本，本专利技术通过一对引物、一条探针同时对两个特异位点进行检测，过扩增毛黄堇药材及其同属近缘物种ITS序列，分析ITS序列中特异性SNP位点，选择2个SNP位点，第一位SNP按扩增阻滞反应设计引物(上/下引物)，第二位SNP设计Taqman探针，通过对上/下引物进行筛选和反应体系优化，最终确定反应体系。
[0020]本专利技术的目的之二在于提供一种快速鉴定毛黄堇药材的检测试剂盒及其鉴定方
法，使用所述试剂盒可稳定有效准确的鉴定出毛黄堇药材，从而有利于毛黄堇药材质量控制，以保障用药安全、有效。
[0021]为实现上述目的，本专利技术采用以下方案：
[0022]本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针，其特征在于，所述新型荧光探针为Dual-SNP-TaqMan荧光探针，所述荧光探针使用的上引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，下引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.根据权利要求1所述的新型荧光探针，其特征在于，所述Dual-SNP-TaqMan荧光探针的上引物根据毛黄堇药材的第一个特异性SNP位点设计，所述第一个特异性SNP位点为毛黄堇药材ITS序列525位C-T的变异。3.根据权利要求1所述的新型荧光探针，其特征在于，所述Dual-SNP-TaqMan荧光探针的Taqman探针根据毛黄堇药材的第二个特异性SNP位点设计，所述第二个特异性SNP位点为毛黄堇药材ITS序列555位的A-G变异。4.制备权利要求1-3任一项所述的快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针的方法，其特征在于，所述方法为以下步骤：1)提取DNA；2)PCR扩增ITS序列并测序分析特异性SNP变异位点；3)根据变异位点设计新型荧光探针的上下引物和探针。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：任风鸣，卓维，
申请(专利权)人：重庆市药物种植研究所，
类型：发明
国别省市：