一种基于CRISPR-Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒及其应用技术方案

本发明专利技术涉及一种用于检测新型冠状病毒的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR
‑
Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，特别是涉及一种基于CRISPR
‑
Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒(Coronavirus)是自然界中广泛存在的一类线性单股正链RNA病毒，于1937年最先从鸡身上分离出来，病毒颗粒的平均直径约为100nm，呈球形或椭圆形，具有包膜且包膜上存在棘突，在电子显微镜下可见如日冕般的外围冠状而被命名为“冠状病毒”。其病毒基因组5
’
端具有甲基化的帽状结构，3
’
端具有多聚A尾，全长约为27
‑
32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，少数可感染人体，引发重症急性呼吸道综合征的SARS
‑
CoV和中东呼吸综合征的MERS
‑
CoV是广为人知的两种。调查显示：与流感类似的多种病原体相比，冠状病毒的感染期更长，可达15天；致死率和基本传染数(R0)更高，分别为0.147％和4.18，冠状病毒的危害性大。
[0003]早期、快速、准确地对无症状的潜伏期感染者进行临床诊断及鉴别，是防控传染性疾病的关键环节：既能为潜伏期病人争取治疗时间，阻断疾病进一步恶化；又能尽早发现传染源，切断传播途径，阻止疾病进一步蔓延。SARS
‑
CoV
‑
2 肺炎的诊断目前主要依赖核酸检测和CT扫描，然而目前的核酸检测耗时较长，所用试剂盒造价较高，检验依赖PCR仪等大型机器且存在一定的假阴性结果； CT结果无法精确鉴别SARS
‑
CoV
‑
2感染性肺炎与非SARS
‑
CoV
‑
2感染引发的肺炎。
[0004]重组聚合酶技术(Recombinase Polymerase Amplificatio，RPA)是由TwistDx 生物技术公司专利技术的一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的体外恒温核酸扩增技术，在23
‑
45℃下连续反应5
‑
20min，即可对微量的靶基因核酸进行大量扩增，扩增效果好且不依赖PCR仪，操作简便，非常适用于病原体的快速诊断与现场检测。2013年在埃及的手足口病病毒(FMDV)爆发中，该技术被成功应用于现场FMDV的快速检测和疫情控制。Euler研发的 RPA检测板可在6
‑
10min内同时检测包括埃博拉病毒、马尔堡病毒、裂谷热病毒、苏丹病毒和天花病毒在内的多种病毒，检测结果特异性强，与人类基因组无交叉反应；灵敏度高，最低可检测为16拷贝的病毒载量。
[0005]CRISPR
‑
Cas系统为存在与大多数细菌与所有古生菌中的一种防御机制，以消灭外来的核酸基因组，由CRISPR序列与Cas家族蛋白两部分组成。CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)序列是一个特殊的 DNA重复序列家族，包含有高度保守长度约为21
‑
48bp的重复序列(repeats) 和26
‑
72bp的间隔序列(spacer)，重复序列被不同的间隔序列隔开，CRISPR 通过间隔序列对靶基因进行识别。Cas(CRISPR associated)位于CRISPR位点附近，是双链DNA核酸酶家族的总称，目前已鉴定出Cas蛋白45个，能在crRNA 引导下对靶位点进行切割。Cas12a属于该家族中的一种，能在crRNA引导下对靶基因进行特定切割，同时被激活的Cas12a可发挥非选择性剪切酶活性，对
所遇到的DNA进行非选择性剪切。利用Cas12a可被crRNA靶向激活的特性，经过特异性地设计，可以用于靶基因的特异性检测。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术的目的之一在于针对新型冠状病毒ORF1 ab和N基因，提出一种CRISPR
‑
Cas系统。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的具体技术方案为：
[0008]一种CRISPR
‑
Cas系统，所述CRISPR
‑
Cas系统包括SARS
‑
CoV
‑
2 ORF1 ab 基因crRNA和N基因crRNA；所述SARS
‑
CoV
‑
2 ORF1 ab基因crRNA由SEQ IDNo.1
‑
SEQ ID No.2所述序列转录得到；所述SARS
‑
CoV
‑
2 N基因crRNA由SEQID No.3
‑
SEQ ID No.4所述序列转录得到。
[0009]在其中一些实施例中，上述CRISPR
‑
Cas系统还包括SARS
‑
CoV
‑
2 ORF1 abdsDNA扩增引物对和SARS
‑
CoV
‑
2 N基因dsDNA扩增引物对；所述SARS
‑
CoV
‑
2ORF1 ab dsDNA扩增引物对包括如SEQ ID No.5所示的上游引物和SEQ ID No.6 所示的下游引物；所述SARS
‑
CoV
‑
2 N基因dsDNA扩增引物对包括如SEQ IDNo.7所示的上游引物和SEQ ID No.8所示的下游引物。
[0010]在其中一些实施例中，上述CRISPR
‑
Cas系统还包括报告DNA链；所述报告DNA链序列如SEQ ID No.9所示，且报告DNA链的5
’
端修饰有荧光基团，3
’
端修饰有淬灭基团。
[0011]在其中一些实施例中，上述报告DNA链的荧光基团选自FAM、TET、CY3、 CY5或ROX，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3。
[0012]在其中一些实施例中，上述CRISPR
‑
Cas系统还包括Cas12a；所述Cas12a 选自MbCas12a、Mb3Cas12a、LbCas12a、FnCas12a、AsCas12a、Lb5Cas12a、 HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a和BoCas12a中的任意一种。
[0013]本专利技术的目的之一还在于提出上述CRISPR
‑
Cas系统在新型冠状病毒检测中的应用。
[0014]本专利技术的目的之一还在于提出一种新型冠状病毒检测试剂盒。
[0015]实现上述目的的技术方案如下：
[0016]一种新型冠状病毒检测试剂盒，包含上述CRISPR
‑
Cas系统。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR
‑
Cas系统，其特征在于，所述CRISPR
‑
Cas系统包括SARS
‑
CoV
‑
2 ORF1 ab基因crRNA和N基因crRNA；所述SARS
‑
CoV
‑
2 ORF1 ab基因crRNA由SEQ ID No.1
‑
SEQ ID No.2所述序列转录得到；所述SARS
‑
CoV
‑
2 N基因crRNA由SEQ ID No.3
‑
SEQ ID No.4所述序列转录得到。2.根据权利要求1所述CRISPR
‑
Cas系统，其特征在于，所述CRISPR
‑
Cas系统还包括SARS
‑
CoV
‑
2 ORF1 ab dsDNA扩增引物对和N基因dsDNA扩增引物对；所述SARS
‑
CoV
‑
2 ORF1 ab dsDNA扩增引物对包括如SEQ ID No.5所示的上游引物和SEQ ID No.6所示的下游引物；所述SARS
‑
CoV
‑
2 N基因dsDNA扩增引物对包括如SEQ ID No.7所示的上游引物和SEQ ID No.8所示的下游引物。3.根据权利要求1所述CRISPR
‑
Cas系统，其特征在于，所述CRISPR
‑
Cas系统还包括报告DNA链；所述报告DNA链序列如SEQ ID No.9所示，且报告DNA链的5
’
端修饰有荧光基团，3
’
端修饰有淬灭基团。4.根据权利要求3所述CRISPR
‑
Cas系统，其特征在于，所述报告DNA链的荧光基团选自FAM、TET、CY3、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3。5.根据权利要求1所述CRISPR
‑
Cas...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐佳，罗良平，石海弘，周峰，洪燕，
申请(专利权)人：江门市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：