利用CAS9核糖核蛋白来产生敲除的原代和扩增的人NK细胞制造技术

公开了用于对NK细胞进行基因工程改造的组合物和方法。组合物和方法。组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用CAS9核糖核蛋白来产生敲除的原代和扩增的人NK细胞

技术介绍

[0001]近年来，癌症免疫疗法有所发展。基因修饰的嵌合抗原受体(CAR)T细胞是成功地应用于癌症免疫疗法中的工程改造的免疫细胞的极好的示例。这些细胞最近被FDA批准用于治疗CD19+B细胞恶性肿瘤，但迄今为止成功仅限于携带少量可靶向抗原的疾病，并且靶向此类有限的抗原储库容易因免疫逃逸而失败。此外，由于同种异体T细胞引起的移植物抗宿主病的风险，CAR T细胞一直专注于自体T细胞的使用。相比之下，NK细胞能够以抗原独立的方式杀死肿瘤靶点，并且不会引起GvHD，这使得它们成为癌症免疫疗法的良好候选者。
[0002]CRISPR/Cas9技术最近已经被用于工程改造免疫细胞，但用质粒对NK细胞进行基因重编程一直是一项挑战。这是由于以DNA依赖性方式进行转基因递送(诸如慢病毒和逆转录病毒转导，其导致大量程序相关的NK细胞凋亡)的困难和基因工程改造的NK细胞的有限产生。需要的是基因工程改造NK细胞的新方法。

技术实现思路

[0003]公开了与基因修饰的NK细胞相关的方法和组合物。
[0004]在一个方面中，本文公开了对NK细胞(诸如，例如原代NK细胞或扩增的NK细胞)进行基因修饰的方法，包含获得对在NK细胞中的靶DNA序列具有特异性的导向RNA(gRNA)(诸如，例如转化生长因子
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β受体2(TGFBR2)或次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1))；以及b)通过电穿孔将核糖核蛋白(RNP)复合物引入到靶NK细胞中，该复合物包含与对应的CRISPR/Cas导向RNA复合的2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，该导向RNA与NK细胞的基因组DNA内的靶序列杂交。
[0005]本文还公开了任何前述方面的方法，其中NK细胞的基因组通过一个或多个碱基对的插入或缺失、通过异源DNA片段(例如供体多核苷酸)的插入、通过内源DNA片段的缺失、通过内源DNA片段的倒位或易位或其组合来修饰。
[0006]在一个方面中，本文公开了对任何前述方面的NK细胞进行基因修饰的方法，其中在转导(诸如电穿孔)之前，将NK细胞(例如原代或扩增的NK细胞)在IL
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2和/或经辐照的饲养细胞的存在下孵育4、5、6或7天。
[0007]本文还公开了对任何前述方面的NK细胞进行基因修饰的方法，进一步包含在电穿孔后，用经辐照的膜结合的表达白介素
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21(mbIL
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21)的饲养细胞扩增经修饰的NK细胞。
[0008]在一个方面中，本文公开了通过任何前述方面的方法制备的修饰的NK细胞。在一个方面中，修饰的NK细胞可以包含编码转化生长因子β受体2(TGFBR2)或次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)的基因的敲除。
[0009]本文还公开了治疗癌症的方法，包含向患有癌症的受试者施用任何前述方面的经修饰的NK细胞。
[0010]在一个方面中，本文公开了向有此需要的受试者过继转移工程改造的NK细胞的方法，所述方法包含a)获得待修饰的靶NK细胞(诸如原代NK细胞或扩增的NK细胞)；b)获得对靶DNA序列具有特异性的gRNA；c)通过电穿孔将RNP复合物引入到靶NK细胞中，所述RNP复合
物包含与对应的CRISPR/Cas gRNA复合的2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，所述CRISPR/Cas gRNA与靶NK细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，产生工程改造的NK细胞；以及d)将工程改造的NK细胞转移到受试者体内。
[0011]本文还公开了向有此需要的受试者过继转移工程改造的NK细胞的方法，其中NK细胞是已经离体修饰并在修饰后转移至受试者的原代NK细胞(诸如，例如，自体NK细胞，或来自同种异体供体来源的NK细胞)。
[0012]在一个方面中，本文公开了向任何前述方面的有此需要的受试者过继转移工程改造的NK细胞的方法，其中在向受试者施用所述经修饰的NK细胞之前、同时或之后，用经辐照的表达mbIL
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21的饲养细胞或施用IL
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21来扩增所述NK细胞。
[0013]在一个方面中，本文公开了向有此需要的受试者过继转移工程改造的NK细胞的方法，其中接受过继转移的修饰的NK细胞的受试者患有癌症。
附图说明
[0014]被并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图示出了若干个实施例，并与说明书一起示出了所公开的组合物和方法。
[0015]图1示出了使用EN
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138程序在NK细胞中表达GFP的siRNA和质粒DNA的电穿孔效率。如此处所示，NK细胞存活率为77.5％，并且35％的活细胞为GFP阳性。
[0016]图2示出了针对电穿孔优化测试的16个程序(DN
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100)中另一个程序的可行性和效率。
[0017]图3示出了通过T7E1突变测定测量的扩增的NK细胞(a)和原代NK细胞(b)中Cas9/RNP介导的TGFBR2敲除。T7E1酶识别并切割错配的DNA。每个小条带(蓝色箭头)代表携带indel的消化的DNA片段。
[0018]图4示出了通过T7E1突变测定测量的扩增的NK细胞中Cas9/RNP介导的HPRT破坏。
[0019]图5示出了使用RT
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PCR在由Cas9/RNP(gRNA1+gRNA2)引入的CRISPR修饰的NK细胞中的TGFBR2胞外域的mRNA表达水平。GAPDH被用作内源对照基因。RNA水平的降低表明TGFBR2基因的破坏。
[0020]图6A示出了Cas9/RNP修饰的(gRNA1+gRNA2、gRNA2和gRNA3)细胞的细胞毒性测定，表明细胞与TGFB一起孵育过夜不会显著地降低其裂解DAOY细胞的能力。
[0021]图6B显示，当与未修饰的NK细胞相比时，Cas9/RNP修饰的细胞(gRNA2和gRNA3)对TGFB不太敏感。
[0022]图7示出了SOCS3基因的外显子2和用于靶向SOCS3基因的外显子2的gRNA。
[0023]图8示出了与野生型NK相比，敲除的NK细胞中Socs3的相对归一化表达水平。
[0024]图9A、9B、9C和9D示出了SOCS3
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KO NK细胞的更好的扩增和细胞毒性。图9A示出了SOCS3
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KO NK细胞针对AML的Incucyte结果。图9B和9C示出了来自3名供体针对DAOY细胞(9B)和神经母细胞瘤细胞系NB1643(9C)的细胞毒性结果。图9D示出了对于图9B和9C中的每个细胞系和处理条件的实际死亡细胞数。
[0025]图10示出了增殖分析，其示出了SOCS3 KO对NK细胞扩增的影响。
[0026]图11示出了野生型和CD38敲除的NK细胞上的CD38表达。
[0027]图12示出了对达雷木单抗介导的自相残杀的耐药性。
[0028]图13示出了Cas9/RN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对NK细胞进行基因修饰的方法，包含：a)获得对靶DNA序列具有特异性的导向RNA(gRNA)；以及b)通过电穿孔将核糖核蛋白(RNP)复合物引入到靶NK细胞中，所述核糖核蛋白(RNP)复合物包含与对应的CRISPR/Cas导向RNA复合的2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，所述CRISPR/Cas导向RNA与所述NK细胞的基因组DNA内的靶序列杂交。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过一个或多个碱基对的插入或缺失、通过异源DNA片段(例如，供体多核苷酸)的插入、通过内源DNA片段的缺失、通过内源DNA片段的倒位或易位或其组合来修饰所述NK细胞的基因组。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述NK细胞是原代NK细胞或扩增的NK细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述原代NK细胞在电穿孔之前在IL
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2的存在下孵育2天、3天或4天。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述原代NK细胞在电穿孔之前在经辐照的饲养细胞的存在下扩增4天。6.根据权利要求1所述的方法，进一步包含在电穿孔后用经辐照的表达mbIL
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21的饲养细胞扩增所述修饰的NK细胞。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包含通过将36μM的cas9稀释到200μM的crRNA和TracerRNA的溶液中来形成所述RNP复合物。8.一种通过权利要求1所述的方法修饰的NK细胞。9.一种基因修饰的NK细胞，包含编码转化生长因子β受体2(TGFBR2)或次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)的基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：全国儿童医院研究所，
类型：发明
国别省市：