一种催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，所述方法包括如下步骤：(1)子囊菌纲Filobasidium属的真菌经过种子培养，制得种子液；(2)按照发酵培养基的体积的5％

【技术实现步骤摘要】
一种催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法


[0001]本专利技术涉及生物制造
，尤其是涉及一种利用微生物发酵香紫苏醇生产香紫苏内酯，提高香紫苏醇利用率和香紫苏内酯产量的方法。

技术介绍

[0002]香紫苏内酯(sclareolide)是一种类倍半萜类物质，是从Salvia sclarea的花中分离出来的一种不溶于水，易溶于有机溶剂的白色结晶状粉末，具有抗菌和细胞毒性的作用，因其具有特殊的香味而被用于香精香料等行业，是一种优良的烟草增香矫味剂。添加到食品中能够增大和提高食品的感官，而广泛用于食品工业。此外在没有心血管刺激作用情况下，当减少身体脂肪时，香紫苏内酯能够帮助增进变瘦身体的质量，因此已经广泛用于减肥产品。目前香紫苏内酯的主要用途是用来合成龙涎香的替代品
‑
降龙涎香醚。
[0003]目前，香紫苏内酯的获得主要是依靠化学方法，比如以香紫苏醇为底物经过一系列的氧化还原反应而获得，或者是从Salvia sclarea的花中提取获得。现在化学合成所使用的传统方法有铬酸酐氧化法，即用铬酸酐氧化香紫苏醇来合成，尽管工艺操作容易，但是收率较低，此外在生产过程中产生的含铬废水对环境污染较大，现在基本不再采用。而目前开发的比如瑞士芬美意公司的臭氧化法；西班牙专利中提出用高碘酸钠和四氧化锇在四氢呋喃中氧化香紫苏醇的方法；美国Reynolds公司的高锰酸钾两部氧化法及中国上海香料所开发出了高锰酸钾低温氧化工艺等均是用化学试剂对香紫苏醇进行氧化而获得香紫苏内酯。但是这些化学试剂的残留以及较差的立体选择性等原因极大的限制了香紫苏内酯的应用。因此新型的香紫苏内酯的生产方法的开发极大的引起了研究者们的关注，比如生物合成法。然而目前有关微生物催化合成香紫苏内酯的文献报道相对较少。
[0004]目前，利用微生物发酵来生产香紫苏内酯仍有一些亟待解决的问题，比如菌株转化效率较差的问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法。本专利技术在发酵体系中添加助溶剂，可以提高底物香紫苏醇在发酵体系中溶解进而提高香紫苏醇的转化率和香紫苏内酯的产量。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，所述方法包括如下步骤：
[0008](1)子囊菌纲Filobasidium属的真菌经过种子培养，制得种子液；
[0009](2)按照发酵培养基的体积的5％
‑
10％的量将步骤(1)所得种子液接入含有香紫苏醇及所需营养物质的发酵培养基中，置于恒温摇床中25
‑
30℃培养60
‑
84 h，制得含香紫苏内酯的发酵液；
[0010]所述发酵培养基中含有助溶剂。
[0011]步骤(1)中，所述真菌已于2021年4月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通
微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.22187。
[0012]步骤(1)中，所述真菌的ITS序列如SEQ ID NO.1所示；所述真菌的18S 序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]步骤(1)中，种子培养的方法为经过二级培养：
[0014]将保藏于甘油管的菌株接种到一级种子培养基中，接种量为一级种子培养基体积的5％，25℃恒温摇床培养36h后得到一级种子菌液；将培养好的一级种子菌液接种到二级种子培养基中，接种量为二级种子培养基体积的5％，25℃恒温摇床培养24h，制得二级种子菌液，所述二级种子菌液的OD
600nm
＝11
‑
16。
[0015]一级种子培养基的组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L， pH＝5。
[0016]二级种子培养基的组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L， pH＝5。
[0017]步骤(2)中，发酵培养基的组成为：
[0018]30g/L香紫苏醇，4
‑
9g/L蛋白胨，2
‑
8g/L酵母粉，0.5
‑
2g/L NH4Cl，0.5
‑
2g/LNaNO3，0.1
‑
1g/L MgSO4·
7H2O，0.5
‑
2g/L KH2PO4，1
‑
4g/L葡萄糖，助溶剂。
[0019]步骤(2)中，发酵培养基中助溶剂与香紫苏醇的添加比例为1:50～10:1。
[0020]所述助溶剂为二氧六环(logP值为
‑
1.1)、PluronicF
‑
127(logP值3)、曲拉通 (logP值4.61)、吐温80(logP值9.39)、大豆油、环糊精(logP值
‑
6.57)、二甲基硅油(logP值
‑
0.327)中的一种或多种。
[0021]步骤(2)中，发酵培养基起始pH为4
‑
9，培养温度25
‑
30℃。
[0022]本专利技术发酵过程优选为：香紫苏醇30g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖4g/L，NH4Cl 2g/L，NaNO
3 2g/L，KH2PO
4 2g/L，MgSO4·
7H2O 1g/L，助溶剂(不同添加比例)，pH＝5的液体培养基中，25℃培养2
‑
3d，取发酵液离心，取1mL离心上清液加入10mL的乙酸乙酯进行萃取，萃取液再稀释10倍后利用GC
‑
MS定性定量检测，色谱条件为：载气为：高纯He；流速1mL/min；Rtx
‑
5ms (0.2um x 0.25mm x 30m)色谱柱；进样口温度280℃；梯度升温程序：180℃， 2min；5℃/min升至280℃维持1min；接口温度250℃，离子源温度200℃。
[0023]优选方案，一种助溶剂为pluronicF
‑
127，其与底物香紫苏醇的添加比例为 1:10，添加方式是助溶剂和对应的底物及无菌水在用高速匀浆机处理后添加入培养基中的方法。
[0024]本专利技术有益的技术效果在于：
[0025]本专利技术二级培养的种子液中二级种子不仅可以进一步提高菌株的活力，同时可以使得菌株尽量处于同一生长水平，保证发酵的平行性较好。
[0026]由于底物不溶于水，因此这极大的阻碍了发酵液中菌体和底物的接触，进而影响底物的转化。本专利技术通过促进发酵过程中底物与菌株的接触，从而促进了菌株对底物香紫苏醇的转化。促进底物转化的助溶剂大致分为两类：
[0027]1类是不容于水的助溶剂(大豆油、二甲基硅油)，这类助溶剂作用是将香紫苏醇溶解于助溶剂内，然后进行双相发酵，该发酵过程中，菌体在水相中(即培养基)生长，底物溶解于助溶剂内。在摇床的搅拌作用下菌株在有机相和水相双相的界面转化底物，相比于对照(不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)子囊菌纲Filobasidium属的真菌经过种子培养，制得种子液；(2)按照发酵培养基的体积的5％
‑
10％的量将步骤(1)所得种子液接入含有香紫苏醇及所需营养物质的发酵培养基中，置于恒温摇床中25
‑
30℃培养60
‑
84h，制得含香紫苏内酯的发酵液；所述发酵培养基中含有助溶剂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述真菌已于2021年4月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.22187。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述真菌的ITS序列如SEQ ID NO.1所示；所述真菌的18S序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，种子培养的方法为经过二级培养：将保藏于甘油管的菌株接种到一级种子培养基中，接种量为一级种子培养基体积的5％，25℃恒温摇床培养36h后得到一级种子菌液；将培养好的一级种子菌液接种到二级种子培养基中，接种量为二级种子培养基体积的5％，25℃恒温摇床培养24h，制得二级种子菌液，所述二级种子菌液的OD
600nm
＝11
‑
16。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张梁，望子龙，方亚坤，辛瑜，顾正华，李由然，徐沙，丁重阳，石贵阳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：