一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法。将钾水玻璃、γ

【技术实现步骤摘要】
一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法


[0001]本专利技术属于色谱领域，具体涉及一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法。

技术介绍

[0002]固定化金属离子亲和层析(IMAC)被用于亲和纯化与金属离子具有结合能力的蛋白质、酶、多肽和氨基酸等。其原理是利用固相载体上的金属离子与蛋白质/多肽暴露出的一些氨基酸或化学修饰基团之间的静电相互作用，对特定的蛋白质/多肽进行富集、纯化，经过三十年来的发展，已逐渐成为分离纯化蛋白质等生物分子最有效的技术之一。
[0003]固定化金属离子亲和层析(IMAC)的核心在于固相基质、配体和金属离子的选择和制备工艺，上样、洗涤和洗脱条件也会影响富集的效果，其性能参数主要包括选择性、灵敏度、重现性、上样量、使用寿命和应用范围等。
[0004]目前商品化IMAC产品的固相基质通常为树脂微球或者磁性颗粒，以便通过离心或者磁吸附的方式进行上样、洗涤、洗脱的流程，亚氨基二乙酸(IDA)、氨基三乙酸(NTA)和乙二胺(TED)是具代表性的用于固定金属离子的螯合配体，它们的羧基和胺基能将Al
3+
、 Fe
3+
、Ga
3+
、Ni
2+
等金属离子螯合在固相基质表面，但是这些组合的螯合性能较差，选择性不高。目前无论是商品化还是文献报道的IMAC材料，通常都是微球或者磁性材料的形式，在离心管中完成对目标蛋白质\多肽的富集，其上样、洗涤、洗脱的流程均需手动进行，较为耗时耗力，另外，目前商品化IMAC材料受国外公司垄断，价格较为昂贵(如：赛默飞货号A32992，4629元30次)。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种具有疏松多孔、比表面积高、背压低、物理化学稳定性好、机械稳定性好、选择性高、灵敏度高、富集倍数高的固定化金属离子亲和色谱柱填料。
[0006]本专利技术的固定化金属离子亲和色谱柱填料，其是通过以下方法制备的：
[0007]将钾水玻璃、γ
‑
缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和水溶解的三磷酸腺苷二钠混合搅拌，然后加入用水溶解的甲酰胺搅拌获得反应液，反应固化获得固体材料，然后洗涤，获得固定化金属离子亲和色谱柱填料。
[0008]本专利技术的固定化金属离子亲和色谱柱填料的制备原理示意如下所示：
[0009]1、钾水玻璃的制备
[0010]mKOH+
n
SiO2→
mK2O
·
(n
‑
m)SiO2+mH2O
[0011]2、钾水玻璃在甲酰胺、加热条件下水解
[0012][0013]3、与步骤2同时进行的硅偶联剂与ATPNa2的反应:
[0014][0015]4、硅胶基底上的ATP修饰
[0016][0017]5、填料发挥富集功能
[0018][0019]优选，
[0020]S1、将钾水玻璃与γ
‑
缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷混合均匀得到S1的混合液；
[0021]S2、将三磷酸腺苷二钠用水溶解后加入到S1的混合液中，得到S2的混合液；
[0022]S3、将甲酰胺用水溶解后加入到S2的混合液中，搅拌获得反应液，反应获得固体材料，然后洗涤，获得固定化金属离子亲和色谱柱填料。
[0023]优选，所述的钾水玻璃的模数范围2
‑
4，波美度范围为20
‑
50。进一步优选是钾水玻璃的模数3.3，波美度为40。
[0024]优选，所述的固化是在温度100℃下固化10小时。
[0025]优选，所述的洗涤是先后用1M硝酸铵、0.1M硝酸和水洗涤。
[0026]优选，所述的钾水玻璃、γ
‑
缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、三磷酸腺苷二钠盐和甲酰胺的用量质量比是500
‑
2000:1
‑
10:2
‑
50:20
‑
130。进一步优选为1000:6:7.5:68。
[0027]本专利技术的第二个目的是提供一种固定化金属离子亲和色谱柱的制备方法，其是通过以下方法制备的：
[0028]是将色谱柱插入上述反应液中，使反应液注满色谱柱，然后注满的色谱柱的反应液反应固化，再经洗涤，获得ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱。
[0029]所述的色谱柱是毛细管，如弹性石英毛细管(外径360微米，内径150微米，长度15 厘米)，制得ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱。
[0030]本专利技术的固定化金属离子亲和色谱柱填料，其具有疏松多孔、比表面积高、背压低、物理化学稳定性好、机械稳定性好、选择性高、灵敏度高、富集倍数高的优点。
[0031]本专利技术通过一步反应法制备的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱，制备步骤简单快速、重复性和良品率高、制备成本低。仅需将原料混合均匀后经历一次烘烤反应便可得到，其物理化学稳定性好，多次使用后具有较好的重现性。与本领域常用的微球或者磁性材料形式的富集材料相比，本专利技术的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱具备与纳升级液相系统联用的潜力，结合自动进样系统，可使劳动密集的上金属离子、上样、洗涤、洗脱等操作自动化进行，同时本专利技术对磷酸化肽的位点覆盖率、检出限、选择性也达到业界一流的水平。
附图说明
[0032]图1是ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱的横切面电镜图，分别为200μm及5μm 尺度。
[0033]图2是ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱富集α
‑
casein酶切产物中磷酸化肽的一级质谱图。
[0034]图3是ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱富集0.2ng和2ngα
‑
casein酶切产物中磷酸化肽的一级质谱图。
[0035]图4是ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱富集2ngα
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casein及2μg BSA酶切产物中磷酸化肽的一级质谱图。
具体实施方式
[0036]下面将结合具体实施例来进一步说明本专利技术,应该说明的是，下述实施例仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行任何形式的限定。本专利技术的设计思想或同类物质的简单替代，均应包含在本专利技术的保护范围之内。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、材料、方法和设备均为本
现有常规的试剂、材料、方法和设备。
[0037]实施例1 ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱的制备
[0038]本专利技术通过一步反应法制备的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱，具体包括以下步骤：
[0039]S1.在微型反应瓶中加入740微升(约1000mg)钾水玻璃(模数3.3，波美度40)，在室温搅拌条件下缓慢加入6微升(约6mg)γ
‑
缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GLYMO，Cas号：2530
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化金属离子亲和色谱柱填料的制备方法，其特征在于，将钾水玻璃、γ
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缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和水溶解的三磷酸腺苷二钠混合搅拌，然后加入用水溶解的甲酰胺搅拌获得反应液，反应固化获得固体材料，然后洗涤，获得固定化金属离子亲和色谱柱填料。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的钾水玻璃、γ
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缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、三磷酸腺苷二钠盐和甲酰胺的用量比是500
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2000:1
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10:2
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50:20
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130。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的钾水玻璃、γ
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缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、三磷酸腺苷二钠盐和甲酰胺的用量质量比是1000:6:7.5:68。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的钾水玻璃的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文洋，晏石娟，黄文洁，吴绍文，殷志斌，孔谦，
申请(专利权)人：广东省农业科学院农业生物基因研究中心，
类型：发明
国别省市：