本发明专利技术公开了鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗及其制备方法，所述三联灭活疫苗包括免疫上有效量的灭活抗原和免疫佐剂，所述灭活抗原包括鸭圆环病毒抗原、新型鸭呼肠弧病毒抗原和鸭肝炎病毒抗原。本发明专利技术进一步公开了制备所述三联灭活疫苗的方法。本发明专利技术鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗安全性良好，不会产生抗原成份的相互干扰或影响。免疫保护效力试验证明，本发明专利技术三联灭活疫苗能够同时预防鸭呼肠弧病毒，鸭圆环病毒和鸭肝炎病毒，可避免多次接种免疫出现的不良反应，具有制备方法简单、方便、多效、低成本、疫苗效价含量高等优点。优点。
【技术实现步骤摘要】
鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗及其制备方法
[0001]本专利技术涉及一种防治鸭病毒病的三联灭活疫苗，尤其涉及鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗，本专利技术进一步涉及该三联灭活疫苗的制备方法，属于鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联疫苗及其制备领域。
技术介绍
[0002]新型鸭呼肠弧病毒病是一种以脾脏肿大、出血、坏死为主要特征的疾病，自2017年以来，在山东、河南、江苏等地区的养鸭场中发现。其易感日龄多在5d
‑
25d范围内，发病率一般在10％
‑
70％之间，死亡率一般在 50％
‑
60％之间。日龄越小，发病和死亡率越高。在天气寒冷的环境下，发病率和死亡率都有明显升高。
[0003]鸭圆环病毒病是危害养鸭业的主要疫病之一，鸭圆环病毒除引起鸭发生原发感染致死亡之外，更严重的是使感染鸭的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，易遭受其他病原的并发或继发感染，使病情加重，造成更大损失。这种可导致机体免疫抑制的病毒，由于经常以亚临诊感染的形式出现，常易被忽视。近年来，随着中国养鸭产业快速发展、养殖规模不断壮大，鸭圆环病的防治逐渐引起重视，但由于鸭圆环病毒在各种细胞系及胚体中增殖均存在困难，因此，以全病毒作为抗原制备疫苗的困难较大。 CHO表达系统具有准确的转录后修饰功能，使表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；重组基因的高效扩增和表达能力；具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高等优点，近年来被广泛用于蛋白的表达。本专利利用CHO表达系统成功表达了鸭圆环病毒Cap蛋白，并制备了一种安全有效的鸭圆环病毒病灭活疫苗。
[0004]鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病。主要特征为肝脏肿大，有出血斑点和神经症状。鸭肝炎病毒有3个血清型，我国主要流行血清1型和3型鸭病毒性肝炎。本病主要发生于4～20 日龄雏鸭，成年鸭有抵抗力，鸡和鸭不能自然发病。病鸭和带毒鸭是主要传染源，主要通过消化道和呼吸道感染。饲养管理不良，缺乏维生素和矿物质，鸭舍潮湿、拥挤，均可促使本病发生。本病发生于孵化雏鸭的季节，一旦发生，在雏鸭群中传播很快，发病率可达100％。
[0005]近年来，中国养鸭产业快速发展、规模不断壮大，但养殖水平和技术相对落后，各种鸭流行性疫病相继发生。从检测中国不同省份的鸭子的病料来看，其中鸭圆环病毒、鸭肝炎及新型呼肠弧病毒是鸭混合感染的常发疫病，给中国养殖业造成了巨大的经济损失。目前尚未有同时防控这三种疫病的有效疫苗，由此尽快研制出一种安全有效的同时防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎的三联灭活疫苗尤为关键。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的之一是提供一种安全且有效的同时防治新型鸭呼肠弧病毒病毒、鸭
圆环病毒病和鸭病毒性肝炎的三联灭活疫苗；
[0007]本专利技术的目的之二是提供一种制备所述的三联灭活疫苗方法。
[0008]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009]本专利技术首先提供了鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗，包括免疫上有效量的灭活抗原和免疫佐剂，其中，所述的灭活抗原包括鸭圆环病毒抗原、新型鸭呼肠弧病毒抗原和鸭肝炎病毒抗原。
[0010]所述的鸭圆环病毒抗原优选是将鸭圆环病毒cap基因经过原核或真核系统重组表达后得到的重组蛋白；最为本专利技术一种优选的具体实施方式，优选为将SEQ ID N.1所示的密码子优化后的鸭圆环病毒cap基因克隆至真核表达质粒并转染CHO细胞，诱导表达是得到的重组鸭圆环病毒cap 蛋白。
[0011]作为参考，本专利技术提供了一种制备重组鸭圆环病毒cap蛋白的方法，包括：
[0012](1)将SEQ IDNo.1所示的密码子优化后的鸭圆环病毒cap基因克隆至pUC
‑
57载体上，采用PCR方法从pUC
‑
DUCV
‑
Cap重组载体中扩增 DUCV
‑
Cap基因片段；
[0013](2)将pCI
‑
GS质粒载体和纯化后的PCR产物使用XhoⅠ、EcoRⅠ酶切，回收酶切的pCI
‑
GS质粒以及DUCV
‑
Cap基因片段并进行连接得到 pCI
‑
DUCV
‑
Cap
‑
GS真核表达质粒；
[0014](3)将pCI
‑
DUCV
‑
Cap
‑
GS真核表达质粒转染CHO细胞，诱导重组 Cap蛋白在CHO细胞中表达，收集所表达的重组Cap蛋白。
[0015]其中，所述的鸭呼肠弧病毒抗原优选是将鸭呼肠弧病毒S株(其微生物保藏编号为：CGMCC No.20000；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期：2020年7月6日；分类命名：新型鸭呼肠弧病毒；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)在LMH 细胞中进行增殖得到的病毒液。
[0016]所述鸭肝炎病毒抗原的制备可以是将1型和3型鸭肝炎病毒生产用毒种接种易感鸭胚，收获胚液，得到鸭肝炎病毒抗原。
[0017]本专利技术的三联联灭活疫苗中，鸭呼肠弧病毒抗原不小于10
8.0
TCID
50
，每羽份疫苗中DUCV
‑
cap蛋白含量不小于5μg，1型和3型鸭肝炎病毒含量应不低于10
5.5
ELD
50
/0.1ml。
[0018]本专利技术中所述的免疫佐剂可以任何一种常规的免疫佐剂，作为本专利技术的一种具体的实施方式，所述的免疫佐剂可以为白油、司班
‑
80(span
‑
80)、硬脂酸铝或吐温
‑
80中的任何一种或多种。
[0019]本专利技术所述灭活疫苗部分还可包括冻干保护剂。
[0020]本专利技术进一步提供了一种制备所新型鸭呼肠弧病毒、鸭圆环病毒病和鸭病毒性肝炎的三联灭活疫苗的方法，包括：
[0021](1)油相制备：取白油与司班
‑
80混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝，搅拌后灭菌，备用；
[0022](2)水相制备：将灭活的鸭呼肠弧病毒抗原，鸭病毒性肝炎抗原以及重组鸭圆环病毒cap蛋白混合得到抗原混合液；抗原混合液与无菌吐温
‑
80 混匀直至吐温
‑
80完全溶解；
[0023](3)乳化：取油相在组织匀浆机内慢速搅拌，同时加入水相，加完水相后再搅拌，即得。
[0024]作为本专利技术的一种优选的实施方案，步骤(1)中将取白油与司班
‑
80 按照94：6的比例混合均匀加入2％的硬脂酸铝；所述的搅拌是搅拌至淡黄色且澄清透明后1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗，包括免疫上有效量的灭活抗原和免疫佐剂，其特征在于，所述的灭活抗原包括鸭圆环病毒抗原、新型鸭呼肠弧病毒抗原和鸭肝炎病毒抗原。2.按照权利要求1所述的鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭圆环病毒抗原是将鸭圆环病毒cap基因经过原核或真核系统重组表达后得到的重组蛋白。3.按照权利要求2所述的鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭圆环病毒抗原是将SEQ ID N.1所示的密码子优化后的鸭圆环病毒cap基因克隆至真核表达质粒并转染CHO细胞诱导表达，得到重组鸭圆环病毒cap蛋白。4.按照权利要求3所述的鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗，其特征在于，将SEQ ID N.1所示的密码子优化后的鸭圆环病毒cap基因克隆至真核表达质粒并转染CHO细胞诱导表达的方法包括：(1)将SEQ ID No.1所示的密码子优化后的鸭圆环病毒cap基因克隆至pUC
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57载体上，采用PCR方法从pUC
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DUCV
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Cap重组载体中扩增DUCV
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Cap基因片段；(2)将pCI
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GS质粒载体和纯化后的PCR产物使用XhoⅠ、EcoRⅠ酶切，回收酶切的pCI
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GS质粒以及DUCV
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Cap基因片段并进行连接得到pCI
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DUCV
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Cap
‑
GS真核表达质粒；(3)将pCI
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DUCV
‑
Cap
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GS真核表达质粒转染CHO细胞，诱导重组Cap蛋白在CHO细胞中表达，收集所表达的重组Cap蛋白。5.按照权利要求1所述的鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭呼肠弧病毒抗原优选是将鸭呼肠弧病毒S株在LMH细胞中进行增殖得到的病毒液；所述鸭呼肠弧病毒S株的微生物保藏编号为：CGMCC No.200...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋扬，柴华，梁宛楠，徐刚，李应鹤，曹宝珠，刘洋，宋莹，张影，孟福强，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：
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