孔蛋白单体的突变体、蛋白孔及其应用制造技术

本发明专利技术属于靶分析物特性的表征技术领域，具体提供了一种孔蛋白单体的突变体、包含其的蛋白孔、以及其检测靶分析物的应用，其中所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括SEQ ID NO:1所示的序列或与其具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列，并且所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括在对应SEQ ID NO:1的T71、S75、F76的一个或多个位置处的突变。或多个位置处的突变。

【技术实现步骤摘要】
孔蛋白单体的突变体、蛋白孔及其应用


[0001]本专利技术属于靶分析物特性的表征
，特别涉及一种孔蛋白单体的突变体、包含其的蛋白孔以及其检测靶分析物的应用。

技术介绍

[0002]随着对核酸结构和序列的研究，核酸测序技术不断发展，成为生命科学研究的核心领域，对生物、化学、电学、生命科学、医学等领域的技术发展起到巨大的推动作用。利用纳米孔研究出新型的快速、准确、低成本、高精度及高通量的核酸测序技术是后人类基因组计划的热点之一。
[0003]纳米孔(Nanopore)测序技术，又被称为第四代测序技术，是一种以单链核酸分子作为测序单元，利用一个能够提供离子电流通道的纳米孔，使得单链核酸分子在电泳驱动下通过该纳米孔，当核酸通过纳米孔时，会减少纳米孔的电流，对产生的不同信号实时读取序列信息的基因测序技术。
[0004]纳米孔测序主要特点是：读长很长，准确率较高，错误区大都发生在均聚寡核苷酸区域。纳米孔测序不但可实现天然DNA和RNA测序还可直接获取DNA和RNA的碱基修饰信息，例如它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行重亚硫酸盐(bisulfite)处理，这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大推动。纳米孔检测技术作为一个新型平台，具有低成本、高通量、非标记等优势。
[0005]纳米孔分析技术起源于Coulter计数器的专利技术以及单通道电流的记录技术。生理与医学诺贝尔奖获得者Neher和Sakamann在1976年利用膜片钳技术测量膜电势，研究膜蛋白及离子通道，推动了纳米孔测序技术的实际应用进程。1996年，Kasianowicz等提出了利用α
‑
溶血素对DNA测序的新设想，是生物纳米孔单分子测序的里程碑标志。随后，MspA孔蛋白、噬菌体Phi29连接器等生物纳米孔的研究报道，丰富了纳米孔分析技术的研究。Li等在2001年开启了固态纳米孔研究的新时代。受限于半导体和材料工业的发展，固态纳米孔测序进展缓慢。
[0006]纳米孔测序技术的关键点之一在于所设计的一种特殊生物纳米孔，孔内缢缩区形成的读取头结构可在当单链核酸(例如ssDNA)分子通过纳米孔时，造成孔道电流的阻塞，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的)，最后高灵敏度的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。目前采用蛋白孔作为纳米孔进行测序，孔蛋白主要以大肠杆菌为来源。
[0007]目前纳米孔蛋白单一，需要开发替代的纳米孔蛋白实现纳米孔测序技术。孔蛋白也与测序精度密切相关，而且孔蛋白还涉及与控速蛋白的相互作用的模式变化，进一步优化孔蛋白与控速蛋白相互作用界面的稳定性，对提高测序数据的一致性和稳定性有积极影响。纳米孔测序技术的准确率也有待改善，因此，需要开发改进的纳米孔蛋白，以进一步提高纳米孔测序的分辨率。

技术实现思路

[0008]为解决上述问题，本专利技术实施例的目的在于提供一种替代的孔蛋白单体的突变体、包含其的蛋白孔、及其应用。
[0009]第一方面，本专利技术实施例提供了一种孔蛋白单体的突变体，其中所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括SEQ ID NO:1所示的序列或与其具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列，或由其组成，并且所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括在对应SEQ ID NO:1的T71、S75、F76中的一个或多个位置处的突变；
[0010]T71、S75、F76中的一个或多个具体为，T71、S75、F76、T71和S75、S75和F76、T71和S76、或T71和S75和F76。
[0011]优选地，所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括在对应SEQ ID NO:1的62
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175、62
‑
104、68
‑
175、64
‑
79、71
‑
76、或69
‑
76的一个或多个位置处的突变。
[0012]优选地，所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括：
[0013](1)对应SEQ ID NO:1的K69、P70、T71、P72、A73、S74、S75、和F76的一个或多个位置处具有氨基酸的插入、缺失和/或替换；(2)对应SEQ ID NO:1的Q64、T65、G66、Q67、Y68、K69、P70、T71、P72、A73、S74、S75、F76、S77、T78、和S79的一个或多个位置处具有氨基酸的插入、缺失和/或替换；(3)对应SEQ ID NO:1的R62、D63、Y68、K69、T71、S75、F76、和E104的一个或多个位置处具有氨基酸的插入、缺失和/或替换；或者(4)对应SEQ ID NO:1的Y68、K69、P70、T71、P72、A73、S74、S75、F76、E171和D175的一个或多个位置处具有氨基酸的插入、缺失和/或替换。
[0014]在一个实施例中，所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸突变选自以下：
[0015](a)对应SEQ ID NO:1的69
‑
76位的氨基酸KPTPASSF突变为M1M2M3M4M5M6M7M8，其中M1选自R、K、H中的0至3种；M2选自P中的0至1种；M3选自S、G、C、U、T、M、A、V、L、I中的0至10种；M4选自P中的0至1种；M5选自A、G、V、L、I中的0至5种；M6选自S、C、U、T、M中的0至5种；M7选自A、T、G、V、L、I、S、C、U、M中的0至10种；M8选自Q、D、E、N、K、H、R中的0至7种；
[0016](b)对应SEQ ID NO:1的64
‑
79位的氨基酸QTGQYKPTPASSFSTS突变为M9M
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M
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M
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M
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M
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M
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，其中M9选自L、G、A、V、I中的0至5种；M
10
选自T、S、C、U、M中的0至5种；M
11
选自G、A、V、L、I中的0至5种；M
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选自Q、D、E、N中的0至4种；M
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选自Y、F、W中的0至3种；M
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选自R、H、K中的0至3种；M
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选自P中的0至1种；M
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选自S、C、U、T、M中的0至5种；M
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选自P中的0至1种；M
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选自A、G、V、L、I中的0至5种；M
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选自S、C、U、T、M中的0至5种；M
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种孔蛋白单体的突变体，其中所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括SEQ ID NO:1所示的序列或与其具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列，并且所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括在对应SEQ ID NO:1的T71、S75、F76的一个或多个位置处的突变。2.根据权利要求1所述的孔蛋白单体的突变体，所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括在对应SEQ ID NO:1的62
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175、62
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104、68
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175、64
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79、71
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76、或69
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76的一个或多个位置处的突变。3.根据权利要求1或2所述的孔蛋白单体的突变体，所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括：(1)对应SEQ ID NO:1的K69、P70、T71、P72、A73、S74、S75、和F76的一个或多个位置处具有氨基酸的插入、缺失和/或替换；(2)对应SEQ ID NO:1的Q64、T65、G66、Q67、Y68、K69、P70、T71、P72、A73、S74、S75、F76、S77、T78、和S79的一个或多个位置处具有氨基酸的插入、缺失和/或替换；(3)对应SEQ ID NO:1的R62、D63、Y68、K69、T71、S75、F76、和E104的一个或多个位置处具有氨基酸的插入、缺失和/或替换；或者(4)对应SEQ ID NO:1的Y68、K69、P70、T71、P72、A73、S74、S75、F76、E171和D175的一个或多个位置处具有氨基酸的插入、缺失和/或替换。4.根据前述权利要求任一项所述的孔蛋白单体的突变体，其中所述SEQ ID NO:1所示的序列来源于绦虫假单胞菌。5.根据前述权利要求任一项所述的孔蛋白单体的突变体，其中所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸突变选自以下：(a)对应SEQ ID NO:1的69
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76位的氨基酸KPTPASSF突变为M1M2M3M4M5M6M7M8，其中M1选自R、K、H中的0至3种；M2选自P中的0至1种；M3选自S、G、C、U、T、M、A、V、L、I中的0至10种；M4选自P中的0至1种；M5选自A、G、V、L、I中的0至5种；M6选自S、C、U、T、M中的0至5种；M7选自A、T、G、V、L、I、S、C、U、M中的0至10种；M8选自Q、D、E、N、K、H、R中的0至7种；(b)对应SEQ ID NO:1的64
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79位的氨基酸QTGQYKPTPASSFSTS突变为M9M
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M
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，其中M9选自L、G、A、V、I中的0至5种；M
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选自T、S、C、U、M中的0至5种；M
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选自G、A、V、L、I中的0至5种；M
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选自Q、D、E、N中的0至4种；M
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选自Y、F、W中的0至3种；M
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选自R、H、K中的0至3种；M
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选自P中的0至1种；M
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选自S、C、U、T、M中的0至5种；M
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选自P中的0至1种；M
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选自A、G、V、L、I中的0至5种；M
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选自S、C、U、T、M中的0至5种；M
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选自A、G、V、L、I中的0至5种；M
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选自N、D、E、Q、L、G、A、V、I中的0至9种；M
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选自S、C、U、T、M中的0至5种；M
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选自T、S、C、U、M中的0至5种；M
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选自A、G、V、L、I中的0至5种；(c)对应SEQ ID NO:1的62位突变为S、C、U、T、M中的0至5种；63位突变为V、G、A、L、I中的0至5种；68位突变为F、W中的0至2种；69位突变为R、H中的0至2种；71位突变为S、C、U、M中的0至4种；75位突变为A、G、V、L、I中的0至5种；76位突变为Q、D、E、N中的0至4种；104位突变为V、G、A、L、I中的0至5种；和(d)对应SEQ ID NO:1的68
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76位的氨基酸YKPTPASSF突变为M
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M
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M
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M
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M
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M
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M
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M
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，并且171位突变为N、D、Q中的0至3种；175位突变为N、E、Q中的0至3种，其中M
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选自F、Y、W中的0至3种；M
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选...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘少伟，谢馥励，何京雄，岳飞飞，李倩雯，
申请(专利权)人：成都齐碳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：