一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用技术

一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物基因工程领域，该重组融合蛋白由人粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素B链截短肽经柔性linker连接而形成，柔性linker为(Gly4Ser)3连接肽。本发明专利技术的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法包括：人粒细胞集落刺激因子突变表达载体构建；大肠杆菌重组表达载体构建；重组hG

【技术实现步骤摘要】
一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物基因工程
，具体涉及一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]粒细胞集落刺激因子(G
‑
CSF)是一种糖蛋白，主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG
‑
CSF
‑
Mut/RTBD1)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。G
‑
CSF临床主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。但是，粒细胞集落刺激因子在临床中存在半衰期短、体内易降解等难题，限制了粒细胞集落刺激因子的临床应用。
[0003]蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)由RTA和RTB两个肽链以二硫键共价连接。其中RTB由262个氨基酸组成。RTB单独存在时没有毒性。目前认为RTB主要有两个功能：1、帮助RTA转运至细胞质内，抑制蛋白质合成；2、RTB增强机体免疫反应。
[0004]目前，将人G
‑
CSF突变体与蓖麻毒素B链截短肽组成重组融合蛋白来提高重组融合蛋白治疗白细胞减少症的活性及延长重组融合蛋白半衰期的研究还未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，以提高重组融合蛋白治疗白细胞减少症的活性，延长重组融合蛋白半衰期，提高白细胞减少症的治疗效果。
[0006]本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，该重组融合蛋白由人粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素B链截短肽经柔性linker连接而形成。
[0008]作为优选的实施方式，所述人粒细胞集落刺激因子突变体的制备过程如下：设计定点突变引物，以重组质粒pUC57
‑
hG
‑
CSF为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，将突变后的序列命名为hG
‑
CSF
‑
Mut；
[0009]所述定点突变引物的序列如下：
[0010]SiteⅠ[0011]Forward：5'
‑
GAGTTTTCTGCTGAAATGCTGGGAACAGGTTCGTAAAATT C
‑
3'；
[0012]Reverse：5'
‑
GAATTTTACGAACCTGTTCCCAGCATTTCAGCAGAAAACTC
‑
3'；
[0013]SiteⅡ[0014]Forward：5'
‑
GTAAAATTCAGGGTAGGGGCGCAGCCCTGCAG
‑
3'；
[0015]Reverse：5'
‑
CTGCAGGGCTGCGCCCCTACCCTGAATTTTAC
‑
3'。
[0016]作为优选的实施方式，将突变后的hG
‑
CSF
‑
Mut序列与蓖麻毒素B链截短肽序列通过柔性linker连接起来形成hG
‑
CSF
‑
Mut/RTBD1序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0017]作为优选的实施方式，所述柔性linker为(Gly4Ser)3连接肽。
[0018]本专利技术的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0019]步骤一、人粒细胞集落刺激因子突变表达载体构建；
[0020]步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；
[0021]步骤三、重组hG
‑
CSF
‑
Mut/RTBD1融合蛋白表达；
[0022]步骤四、重组hG
‑
CSF
‑
Mut/RTBD1融合蛋白纯化与复性。
[0023]作为优选的实施方式，步骤一具体包括以下步骤：
[0024](1)通过SWISS
‑
MODEL在线平台对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行同源建模；通过Z
‑
DOCK方法对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行对接，得到复合物结构模型；通过丙氨酸扫描对上述复合物结构模型全长序列进行突变，获得潜在的突变位点；通过虚拟饱和突变对单个突变位点计算突变前后的分子间结合力变化；
[0025](2)重组质粒pUC57
‑
hG
‑
CSF的制备：
[0026]通过NCBI Genbank数据库查询人粒细胞集落刺激因子基因序列，将获取的序列进行全基因合成，合成过程中以大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后，克隆至大肠杆菌克隆载体pUC57中，获得大肠杆菌重组克隆载体pUC57
‑
hG
‑
CSF；
[0027](3)设计定点突变引物，其序列如下：
[0028]SiteⅠ[0029]Forward：5'
‑
GAGTTTTCTGCTGAAATGCTGGGAACAGGTTCGTAAAATT C
‑
3'；
[0030]Reverse：5'
‑
GAATTTTACGAACCTGTTCCCAGCATTTCAGCAGAAAACTC
‑
3'；
[0031]SiteⅡ[0032]Forward：5'
‑
GTAAAATTCAGGGTAGGGGCGCAGCCCTGCAG
‑
3'；
[0033]Reverse：5'
‑
CTGCAGGGCTGCGCCCCTACCCTGAATTTTAC
‑
3'；
[0034](4)以重组质粒pUC57
‑
hG
‑
CSF为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，并将突变后的序列命名为hG
‑
CSF
‑
Mut；将突变后的hG
‑
CSF
‑
Mut序列与蓖麻毒素B链截短肽序列通过柔性linker连接起来形成hG
‑
CSF
‑
Mut/RTBD1序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，其特征在于，该重组融合蛋白由人粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素B链截短肽经柔性linker连接而形成。2.根据权利要求1所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，其特征在于，所述人粒细胞集落刺激因子突变体的制备过程如下：设计定点突变引物，以重组质粒pUC57
‑
hG
‑
CSF为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，将突变后的序列命名为hG
‑
CSF
‑
Mut；所述定点突变引物的序列如下：SiteⅠForward：5'
‑
GAGTTTTCTGCTGAAATGCTGGGAACAGGTTCGTAAAATTC
‑
3'；Reverse：5'
‑
GAATTTTACGAACCTGTTCCCAGCATTTCAGCAGAAAACTC
‑
3'；SiteⅡForward：5'
‑
GTAAAATTCAGGGTAGGGGCGCAGCCCTGCAG
‑
3'；Reverse：5'
‑
CTGCAGGGCTGCGCCCCTACCCTGAATTTTAC
‑
3'。3.根据权利要求2所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，其特征在于，将突变后的hG
‑
CSF
‑
Mut序列与蓖麻毒素B链截短肽序列通过柔性linker连接起来形成hG
‑
CSF
‑
Mut/RTBD1序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.根据权利要求1所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，其特征在于，所述柔性linker为(Gly4Ser)3连接肽。5.如权利要求1
‑
4中任意一项所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、人粒细胞集落刺激因子突变表达载体构建；步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；步骤三、重组hG
‑
CSF
‑
Mut/RTBD1融合蛋白表达；步骤四、重组hG
‑
CSF
‑
Mut/RTBD1融合蛋白纯化与复性。6.根据权利要求5所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤一具体包括以下步骤：(1)通过SWISS
‑
MODEL在线平台对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行同源建模；通过Z
‑
DOCK方法对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行对接，得到复合物结构模型；通过丙氨酸扫描对上述复合物结构模型全长序列进行突变，获得潜在的突变位点；通过虚拟饱和突变对单个突变位点计算突变前后的分子间结合力变化；(2)重组质粒pUC57
‑
hG
‑
CSF的制备：通过NCBI Genbank数据库查询人粒细胞集落刺激因子基因序列，将获取的序列进行全基因合成，合成过程中以大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后，克隆至大肠杆菌克隆载体pUC57中，获得大肠杆菌重组克隆载体pUC57
‑
hG
‑
CSF；(3)设计定点突变引物，其序列如下：SiteⅠForward：5'
‑
GAGTTTTCTGCTGAAATGCTGGGAACAGGTTCGTAAAATTC
‑
3'；
Reverse：5'
‑
GAATTTTACGAACCTGTTCCCAGCATTTCAGCAGAAAACTC
‑
3'；SiteⅡForward：5'
‑
GTAAAATTCAGGGTAGGGGCGCAGCCCTGCAG
‑
3'；Reverse：5'
‑
CTGCAGGGCTGCGCCCCTACCCTGAATTTTAC
‑
3'；(4)以重组质粒pUC57
‑
hG
‑
CSF为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，并将突变后的序列命名为hG
‑
CSF
‑
Mut；将突变后的hG
‑
CSF
‑
Mut序列与蓖麻毒素B链截短肽序列通过柔性linker连接起来形成hG
‑
CSF
‑
Mut/RTBD1序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并插入至pMD18T载体，将测序正确的产物命名为pMD18T
‑
hG
‑
CSF
‑
Mut/RTBD...

【专利技术属性】
技术研发人员：许娜，孙成彪，石晶，王燕，
申请(专利权)人：长春萤火虫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：