苏氨酸醛缩酶的突变体及其在制备取代苯丝氨酸衍生物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了苏氨酸醛缩酶的突变体、突变体的编码基因、编码基因构建的重组载体、重组载体转化获得的重组基因工程菌及苏氨酸醛缩酶的突变体在制备2

【技术实现步骤摘要】
苏氨酸醛缩酶的突变体及其在制备取代苯丝氨酸衍生物中的应用
[0001]本申请为申请号201811310893.4、申请日2018年11月6日、专利技术名称“苏氨酸醛缩酶、突变体及其在制备取代苯丝氨酸衍生物中的应用”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及生物
，具体涉及苏氨酸醛缩酶的突变体及其在制备2
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位取代的苯丝氨酸衍生物中的应用。

技术介绍

[0003]2‑
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位取代的苯丝氨酸衍生物是一种重要的药物中间体和化工中间体，特别是4
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甲砜基苯丝氨酸，广泛用于人类抗生素，家禽家畜类抗生素制备等，其代表药物如氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考等等。
[0004]2‑
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位取代的苯丝氨酸衍生物合成方法主要包括化学合成法和酶催化法。其中，化学合成法主要是通过加成反应，酯化反应和化学拆分法来得到手性的2
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位取代的苯丝氨酸衍生物，虽然化学法操作简单，但是反应过程中用到了大量的水，重金属和剧毒的硫化氢，并且有大量的光学异构体作为副产物，不符合目前和将来国家提倡和推进的原子经济学和环境保护政策。而酶催化法具有条件温和，用水量少(仅为化学法的十分之一)，没有重金属污染，不使用剧毒化学品，手性选择高等诸多优点，具有很好的应用前景。
[0005]苏氨酸醛缩酶有着十分广泛的应用潜力，它可以催化合成手性的医药关键中间体β
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羟基
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α
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氨基酸。但是由于苏氨酸醛缩酶的稳定性不好，手性选择性特别是β
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羟基的手性选择性不足，限制了此酶在手性合成中的应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供苏氨酸醛缩酶的突变体及其在制备2
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位取代的苯丝氨酸衍生物中的应用，以解决现有技术的不足。
[0007]本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供了苏氨酸醛缩酶的突变体，是建立在新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)来源的苏氨酸醛缩酶的两个位点的单点突变，新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的苏氨酸醛缩酶氨基酸序列为SEQ ID NO：19所示，其突变位点和原始位氨基酸列表如下：
[0009][0010][0011]其对应可更换的氨基酸如下：第一突变点H更换为S，第二突变点A更换为Y；其中，Cc_LTA
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来源于新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的苏氨酸醛缩酶，H
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组氨酸，S
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丝胺
酸，A
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丙氨酸，Y
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酪氨酸；
[0012]新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的苏氨酸醛缩酶的突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：36所示。
[0013]第二方面，本专利技术提供了上述苏氨酸醛缩酶的突变体的编码基因。
[0014]第三方面，本专利技术提供了上述编码基因构建的重组载体，这些重组载体可通过本领域常规方法将本专利技术的苏氨酸醛缩酶的突变体的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒载体等。
[0015]第四方面，本专利技术提供了上述重组载体转化获得的重组基因工程菌，可通过将本专利技术的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本专利技术的苏氨酸醛缩酶的突变体的基因可以有效表达，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，棒杆菌，酵母等。
[0016]第五方面，本专利技术提供了上述苏氨酸醛缩酶的突变体在制备2
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位取代的苯丝氨酸衍生物中的应用。
[0017]进一步地，以苏氨酸醛缩酶或苏氨酸醛缩酶的突变体为催化剂，以2
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位取代的苯甲醛为底物，以5
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磷酸吡哆醛为辅酶，以甘氨酸/甘氨酸酯为辅底物，控制温度和搅拌速度的条件下，在反应介质里进行酶催化，反应结束后，分离纯化，获得2
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位取代的苯丝氨酸衍生物。
[0018]进一步地，所述底物为下列之一：苯甲醛，2
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氯苯甲醛，2
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氟苯甲醛，2
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溴苯甲醛，2
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硝基苯甲醛，2
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甲砜基苯甲醛，2
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羟基苯甲醛，3
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氯苯甲醛，3
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氟苯甲醛，3
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溴苯甲醛，3
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硝基苯甲醛，3
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甲砜基苯甲醛，3
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羟基苯甲醛，4
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氯苯甲醛，4
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氟苯甲醛，4
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溴苯甲醛，4
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硝基苯甲醛，4
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甲砜基苯甲醛，4
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羟基苯甲醛；所述辅底物为下列之一：L
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甘氨酸，L
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甘氨酸盐酸盐，L
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甘氨酸甲酯盐酸盐，L
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甘氨酸乙酯盐酸盐，N
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Boc
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L
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甘氨酸，N
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Boc
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L
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甘氨酸乙酯，N
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Z
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L
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甘氨酸，N
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Z
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L
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甘氨酸乙酯，N
‑
Z
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L
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甘氨酸甲酯；反应介质为下列之一：pH 8
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9的磷酸缓冲体系，水
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乙醇体系，水
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甲醇体系，甲醇体系，乙醇体系。
[0019]进一步地，酶的用量为50
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1000mg/L，底物浓度为1
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100g/L，甘氨酸/甘氨酸酯浓度为5
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200g/L，5
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磷酸吡哆醛浓度为0.01
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0.2g/L，控制温度在25
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45℃，搅拌速度70
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300rpm。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]1、本专利技术通过对新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)来源的苏氨酸醛缩酶进行定点突变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.苏氨酸醛缩酶的突变体，其特征在于，是建立在新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)来源的苏氨酸醛缩酶的两个位点的单点突变，新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的苏氨酸醛缩酶氨基酸序列为SEQ ID NO：19所示，其突变位点和原始位氨基酸列表如下：苏氨酸醛缩酶第一突变点第二突变点CcLTAH91A178其对应可更换的氨基酸如下：第一突变点H更换为S，第二突变点A更换为Y；其中，Cc_LTA
‑
来源于新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的苏氨酸醛缩酶，H
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组氨酸，S
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丝胺酸，A
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丙氨酸，Y
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酪氨酸；新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的苏氨酸醛缩酶的突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：36所示。2.权利要求1所述苏氨酸醛缩酶的突变体的编码基因。3.权利要求2所述编码基因构建的重组载体。4.权利要求3所述重组载体转化获得的重组基因工程菌。5.权利要求1所述苏氨酸醛缩酶的突变体在制备2
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位取代的苯丝氨酸衍生物中的应用。6.权利要求5所述的应用，其特征在于，以苏氨酸醛缩酶的突变体为催化剂，以2
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位取代的苯甲醛为底物，以5
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磷酸吡哆醛为辅酶，以甘氨酸/甘氨酸酯为辅底物，控制温度和搅拌速度的条件下，在反应介质里进行酶催化，反应结束后，分离纯化，获得2
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位取代的苯丝氨酸衍生物。7.权利要求6所述的的应用，其特征在于，所述底物为下列之一：苯甲醛，2
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氯苯甲醛，2
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氟苯甲醛，2
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溴苯甲醛，2
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硝基苯甲醛，2
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甲砜基苯甲醛，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喆明，张荣珍，谭昊，李利宏，
申请(专利权)人：杭州法哲罗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：