一步法催化合成L-肌肽的方法技术

一步法催化合成L

【技术实现步骤摘要】
一步法催化合成L
‑
肌肽的方法


[0001]本专利技术属于有机物合成
，具体涉及一种一步法催化合成L
‑
肌肽的方法。

技术介绍

[0002]L
‑
肌肽(β
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丙氨酰
‑
L
‑
组氨酸)及其类似物(如高肌肽和鹅肌肽)是广泛存在于哺乳动物的大脑、肌肉和其他重要组织中的天然活性二肽，具有很强的抗氧化能力。目前已报道的L
‑
肌肽合成工艺主要分为两类：一类是化学法合成(即化学合成方法，以下同)，另一类是生物催化法合成(即生物催化合成方法，以下同)。
[0003]化学合成方法虽然比较多，但主要有以下两种：一是利用β
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丙氨酸参与合成。其主要路线是β
‑
丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L
‑
组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到L
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肌肽。该路线由于各个保护基团的差异导致合成路线较多。其中常用的是利用邻苯二甲酸酐与β
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丙氨酸生成邻苯二甲酰
‑
β
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丙氨酸保护氨基，羧基与氯化亚砜反应生成邻苯二甲酰
‑
β
‑
丙氨酰氯，再与保护的L
‑
组氨酸形成肽键后脱保护基团得到产品。该路线比较复杂，收率低，肽键形成过程中易消旋，影响产品纯度，并且溶剂消耗大，易造成环境污染；二是摒弃β
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丙氨酸参与的反应。主要原理为L<br/>‑
组氨酸先与不同的β
‑
丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为肌肽。常用的路线是在醇钠作用下，L
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组氨酸和氰乙酸乙酯发生酰化反应，得到氰基乙酰
‑
L
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组氨酸，经催化氢化还原得L
‑
肌肽。该路线相对简单，省去对不同基团的保护和脱保护的过程，避免消旋反应的发生，但是需要无水操作，要求比较严格。以上的路线随着工艺的差异，产品得率大约在60％
‑
80％左右。
[0004]前述的化学合成路线是目前L
‑
肌肽的主要生产路线。尽管不断有针对前述路线的改良方法的报道，比如改变β
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丙氨酸的前体分子、醇钠的替换、无溶剂反应体系等以提高产品得率，降低反应的操作复杂程度，但是这些方法依然不能有效地避免化学合成法在合成条件上所要求的保护基团的添加与脱除、反应温度变化剧烈、pH调整频繁、反应压力高、多相反应体系复杂、溶剂易燃易爆有毒、中间产物分离过程繁琐等诸多不利因素。
[0005]为了避免并非限于例举的以上不利因素，近年来，国外有研究者开始致力于利用酶或者细胞在温和的条件下合成L
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肌肽。主要的情况如下：
[0006](1)基于β
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氨肽酶的L
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肌肽合成
[0007]β
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氨肽酶是一类功能和结构相似的酶，具有催化含β
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氨基酸残基的酰胺键或者肽健发生水解或者氨解反应的活力。其机理是底物与酶形成酰基化的中间物，再与水或者另一个氨基酸发生亲核作用，进而完成水解或氨解反应。因该酶对含β
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氨基酸肽底物的特殊催化活力，故具备了合成β肽的潜力。根据该酶的催化机制，Heyland,Jan等人开发了基于大肠杆菌全细胞合L
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肌肽的催化系统，其反应式即β
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氨肽酶合成L
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肌肽的反应式如下：
[0008][0009]为使反应倾向于L
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肌肽的合成，采用β
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丙氨酰胺和L
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组氨酸作为反应底物参与反应。经优化后，L
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肌肽的得率达到71％，生产强度为3.3mM/l/h。全细胞经5次重复利用表明，L
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肌肽的合成效率没有显著变化。该方法制备L
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肌肽虽然生产强度和得率均不高，但是避免了大量有机溶剂的使用，操作过程温和并且细胞在反应体系中鲁棒性(Robustness)好，可多次重复利用，有效减少上、下游的处理过程。该报道表明，利用全细胞催化，一步法合成L
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肌肽在理论及实践上都是可行的。
[0010](2)基于L
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肌肽酶的L
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肌肽合成
[0011]L
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肌肽酶是存在于细胞内和细胞外的二肽酶。其中人源血清肌肽酶(CN1)可催化Xaa
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His二肽的水解，以维持血清中肌肽的平衡。Chiaki Inaba等人利用人源肌肽酶CN1与α凝集素的细胞壁粘附域连接，构建了基于酿酒酵母细胞表面展示技术的全细胞一步法合成L
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肌肽的催化体系。相比Heyland,Jan等人开发的大肠杆菌催化体系，该细胞可直接催化廉价的β丙氨酸和L
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组氨酸合成L
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肌肽。但是，由于合成L
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肌肽是L
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肌肽酶催化水解二肽的逆反应，为避免水分子的影响，该合成过程需要在有机溶剂或者疏水离子液体中进行。尽管如此，该细胞展示体系的L
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肌肽合成效率仅有5％，与商业化应用还存在较大的距离。本段内容所讲的L
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肌肽酶催化合成L
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肌肽的反应式如下：
[0012][0013]由于上述两种全细胞一步法合成肌肽都是建立在二肽酶的基础上进行的，因而突出的问题在于无法避免肽酶对L
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肌肽的水解作用，从而导致整个催化体系依然相对比较复杂，合成效率和产品得率不足以与化学法相提并论。
[0014]基于上述，探索工艺步骤合理、可在水相中进行反应而不影响反应进程和细胞活力、摒弃化学合成法所需要的基团保护与脱保护、免用有毒有害溶剂、有助于节能等的合成L
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肌肽的方法具有积极意义，下面将要介绍的技术方案便是在这种背景下产生的。

技术实现思路

[0015]本专利技术的任务在于提供一种一步法催化合成L
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肌肽的方法，该方法有助于避免化学合成法所依赖的基团保护和脱保护、有利于免用有毒有害溶剂而得以体现绿色环保生产、有益于摒弃高温高压而得以体现节能。
[0016]本专利技术的任务是这样来完成的，一步法催化合成L
‑
肌肽的方法，其是在填充床反应器中进行酶合成反应，先将L
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肌肽酶构建全细胞催化剂装入填充床中，再加入含有β
‑
丙
氨酸、L
‑
组氨酸以及催化剂的反应液，以外循环形式流过填充床进行反应转化，反应结束后用高效液相色谐分析测定反应转化率，收集反应液，离心分离，将离心分离获得的全细胞继续催化实现循环利用，得到高浓度的L
‑
肌肽。
[0017]在本专利技术的一个具体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一步法催化合成 L
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肌肽的方法，其特征在于其是在填充床反应器中进行酶合成反应，先将L
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肌肽酶构建全细胞催化剂装入填充床中，再加入含有β
‑
丙氨酸、L
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组氨酸以及催化剂的反应液，以外循环形式流过填充床进行反应转化，反应结束后用高效液相色谐分析测定反应转化率，收集反应液，离心分离，将离心分离获得的全细胞继续催化实现循环利用，得到高浓度的L
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肌肽。2.根据权利要求1所述的一步法催化合成 L
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肌肽的方法，其特征在于所述的L
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肌肽酶构建全细胞催化剂为毕赤酵母的胞内表达载体；所述L
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肌肽酶构建全细胞催化剂在所述反应液中的加入量为25～50g/L，活力80U/L～150U/L。3.根据权利要求1所述的一步法催...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁建飞，钱庆，陆建刚，
申请(专利权)人：苏州富士莱医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：