一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株构建方法及获得的菌株技术

本发明专利技术提供一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株构建方法及获得的菌株，所述方法包括将所述菌株中包含的prfA基因的表达改造为可受控制。利用本发明专利技术的方法构建的菌株能够高效的生产出含非天然氨基酸的完整蛋白，大幅度降低截断蛋白产生的同时，菌株还能够保持高速生长。生长。

【技术实现步骤摘要】
一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株构建方法及获得的菌株


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及生产非天然氨基酸的菌株的构建。

技术介绍

[0002]琥珀密码子(amber)UAG是在大肠杆菌中的使用频率最低的终止密码子，大约7％，当被改造成编码某种非天然氨基酸时，能够影响的内源蛋白质最少，所以是最常被用于建立基因密码子扩展技术的一种密码子。在普通大肠杆菌中通过辅助质粒表达非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶，再通过表达载体在重组蛋白的阅读框中定点引入琥珀密码子，就可以生产定点插入非天然氨基酸的重组蛋白。但是由于大肠杆菌胞内本身存在将琥珀密码子识别为终止密码子的肽链释放因子RF1，因此导致定点插入非天然氨基酸的重组蛋白产率较低，且存在大量因提前翻译终止而产生的不完整蛋白；甚至一些特殊重组蛋白的结构严重阻碍了某些位点非天然氨基酸插入，因而难以获得完整的含非天然氨基酸重组蛋白。通过直接基因敲除RF1的编码基因prfA来抑制RF1和非天然氨基酸竞争，会导致菌株生长速率大幅度降低，难以应用于工业化发酵生产。

技术实现思路

[0003]本专利技术通过对大肠杆菌中RF1蛋白表达的改造，解决上述现实问题。
[0004]在第一个方面，本专利技术提供一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株的构建方法，包括，将所述菌株中包含的prfA基因的表达改造为可受控制。
[0005]为实现该方法，可以将所述菌株基因组中prfA基因的表达改造为抑制表达或可诱导表达。
[0006]在一种实施方式中，将所述菌株基因组中的prfA基因的表达改造为抑制表达，同时向菌株中引入含有prfA基因、能够表达RF1的质粒，其中，所述质粒中的prfA基因的表达或复制受控制。
[0007]优选地，所述质粒中prfA基因的启动子为可诱导表达启动子，以实现可诱导表达。所述可诱导表达启动子如乳糖诱导的tac启动子(GenBank:K01728.1)、lacUV5启动子(GenBank:E02301.1)、T7启动子(GenBank:M38302.1)、T5启动子(GenBank:X00126.1)、阿拉伯糖诱导的araBAD启动子(GenBank:K00953.1)、热诱导的pR/pL启动子(Winstanley,C.,et al."Differential regulation of lambda pL and pR promoters by a cI repressor in a broad
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host
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range thermoregulated plasmid marker system."Applied and Environmental Microbiology 55.4(1989):771
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777.)等。
[0008]优选地，所述质粒中prfA基因的复制起始位点为条件缺失型复制起始位点，实现质粒在特定条件下停止复制，从而达到控制prfA基因表达的目的。所述条件缺失型复制起始位点如高温条件缺失型复制起始位点pSG5(GenBank:NC_008792.1)、pSC101(GenBank:K00042.1)等。
[0009]优选地，将所述基因组中的prfA基因的表达改造为抑制表达是通过基因敲除、基因沉默、基因突变等方式实现，使基因组中的prfA基因不表达RF1蛋白。如，通过在prfA基因两端引入loxP位点，再在适当时间点使用Cre重组酶可诱导基因敲除。
[0010]在一种实施方式中，将所述菌株基因组中的prfA基因的表达改造为可诱导表达，通过将基因组上的prfA基因启动子更换为可诱导表达启动子。
[0011]优选地，所述菌株为大肠杆菌。
[0012]其中，prfA基因(Genebank Gene ID:949002)的基因序列、可诱导表达启动子(例如乳糖诱导的tac启动子、lacUV5启动子、T7启动子、T5启动子，阿拉伯糖诱导的araBAD启动子、热诱导的pR/pL启动子等)和复制起始位点等元件都是本领域技术人员能够根据各种基因数据库可查到的。
[0013]进一步优选地，所述方法还包括，在菌株中引入编码与天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶正交的非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的质粒，这样可以利用琥珀密码子(UAG)编码非天然氨基酸，通过在重组蛋白的编码框中定点插入琥珀密码子，可以生产定点插入非天然氨基酸的重组蛋白。所述与天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶正交的非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的质粒如pUltra
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pylRS辅助质粒，本领域技术人员可以利用addgene网站(https://www.addgene.org/collections/genetic
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code
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expansion/)找到相关信息。
[0014]在一种优选的实施方式中，一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株的构建方法，所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株，该方法包括：
[0015](1)通过CRISPR技术敲除菌株基因组的prfA基因；
[0016](2)构建含pSG5复制起始位点和araBAD启动子以及prfA基因的质粒；
[0017](3)向步骤(1)得到的菌株基因组prfA基因敲除的菌株中转入步骤(2)的质粒和表达非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的辅助质粒，如pUltra
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pylRS辅助质粒，即得。
[0018]在第二个方面，提供一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株，所述菌株能够表达与天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶正交的非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶，并且所述菌株中prfA基因的表达受控制。
[0019]优选地，上述菌株通过本专利技术的方法构建获得。
[0020]在第三个方面，提供一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的方法，包括：将编码所述重组蛋白的基因引入本专利技术所述的菌株中，培养所述菌株，使其表达所述重组蛋白。
[0021]优选地，所述方法包括：1)构建prfA基因表达受控制的菌株；2)向菌株中引入表达非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的辅助质粒及表达目的重组蛋白的表达质粒；3)在菌株生长阶段，诱导prfA基因表达；在重组蛋白表达阶段，诱导prfA基因停止表达，同时诱导重组蛋白表达。
[0022]在本专利技术中，RF1的编码基因prfA的表达受到控制，可以获得接近100％将UAG用于编码非天然氨基酸的菌株，在菌株扩增阶段控制菌株产生足量RF1来维持菌株的高速生长，而在诱导表达阶段使pfrA基因不表达，从而接近100％的产能用于生产完整的重组蛋白。利用本专利技术的方法构建的菌株能够高效的生产出含非天然氨基酸的完整蛋白，大幅度降低截断蛋白产生的同时，菌株还能够保持高速生长。
附图说明
[0023]图1示出了大肠杆菌中prfA基因的敲除，其中图A为示意图，图B为筛选时凝胶电泳结果；
[0024]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株的构建方法，其中，将所述菌株中包含的prfA基因的表达改造为可受控制。2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，将所述菌株基因组中的prfA基因的表达改造为抑制表达，同时向菌株中引入含有prfA基因、能够表达RF1的质粒，其中，所述质粒中的prfA基因的表达或复制受控制。3.根据权利要求2所述的构建方法，其中，所述质粒中prfA基因的启动子为可诱导表达启动子；优选地，所述可诱导表达启动子为tac启动子、lacUV5启动子、T7启动子、T5启动子、araBAD启动子或pR/pL启动子；和/或所述质粒中prfA基因的复制起始位点为条件缺失型复制起始位点；优选地，所述条件缺失型复制起始位点为高温条件缺失型复制起始位点pSG5或pSC101。4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其中，将所述基因组中的prfA基因的表达改造为抑制表达是通过基因敲除、基因沉默或基因突变实现。5.根据权利要求1所述的构建方法，其中，将所述菌株基因组中的prfA基因的表达改造为可诱导表达，将所述菌株基因组中的prfA基因启动子更换为可诱导表达启动子；优选地，所述可诱导表达启动子为tac启动子、lacUV5启动子、T7启动子、T5启动子、araBAD启动子或pR/pL启动子。6.根据权利要求1～5任一项所述的构建方法，其中，所述方法还包括，在菌株中引入编码与天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶正交的非天然氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈龙飞，焦琳，应跃斌，巩尊洋，宫丽颖，祝静静，梁学军，
申请(专利权)人：浙江新码生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：