一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种耐盐β

【技术实现步骤摘要】
一种耐盐
β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]β
‑
半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)能够催化乳糖水解生成半乳糖和葡萄糖；其次该酶具有将乳糖催化形成低聚半乳糖的转糖基活性。乳糖是一种二糖，在哺乳动物的乳汁中含量丰富，对新生儿的营养至关重要；可被肠道中的乳糖酶水解成可吸收的葡萄糖和半乳糖。耐盐β
‑
半乳糖苷酶在高盐浓度中具有较高的酶活，在高盐工艺的食品工业中消化植物多糖。此外，还可合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因。GOS由β
‑
半乳糖苷酶通过乳糖水解过程中的转糖基化活性产生的，为食品中不可消化的益生元的成分，对人体健康至关重要，且酶法制备GOS具有简单、高效、量大、副反应较少等优势。
[0003]目前主要采取β
‑
半乳糖苷酶水解乳糖的方法制备GOS。GOS具有促进益生菌增殖预防和治疗便秘等功能；其次，在食品工业中用作发酵乳产品、面包和饮料等低热量甜味剂；在婴幼儿配方奶粉、烘焙食品和宠物食品等诸多领域有着广泛的应用。此外，可解决乳糖不耐的问题。此外，在酸性条件下可于室温下长时间保存并应用于各种产品而不会分解，故其在乳清和牛奶加工市场应用前景非常广阔。因此开发多功能的β
‑
半乳糖苷酶具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13及其制备方法和应用，同时还提供了该水解酶的构建方法，本专利技术耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13不仅具有良好的耐盐特性，还具有高效转糖基活性和高效水解乳糖活性。
[0005]为了实现上述技术目的，本专利技术具体采用以下技术方案：
[0006]一种耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13，所述β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13来源于动物粪便微生物宏基因组，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，共592个氨基酸，理论分子量为67.83kDa。
[0007]所述β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13最适作用pH为6.5，在pH 6.0、pH 6.5下处理1h，其剩余酶活分别为130％、132％；最适作用温度为37℃，在37℃条件下耐受0.5h达到半衰期；该酶具有较好的NaCl稳定性，在NaCl浓度为0.5mol/L时酶活性达到最大(约2倍)。在0.5
‑
1.0mol/LNaCl浓度下可达200％以上；1.5mol/L NaCl浓度下维持190％活性；在2.0
‑
2.5mol/L浓度下均保持在130％以上；即使在3.0
‑
5.0mol/LNaCl下也能维持在65％
‑
95％。
[0008]在本专利技术的另一方面，提供了所述耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因大小为1779bp。
[0009]在本专利技术的另一方面，提供了包含所述耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为pEASY
‑
E2/GalNC2
‑
13。
[0010]在本专利技术的另一方面，提供了包含所述耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13编码基因的重组菌株，所述菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/GalNC2
‑
13。
[0011]本专利技术通过PCR的方法克隆到β
‑
半乳糖苷酶编码基因，将β
‑
半乳糖苷酶编码基因GalNC2
‑
13与质粒pEASY
‑
E2连接得到重组表达载体，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌。
[0012]在本专利技术的另一方面，提供了所述耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13的制备方法，包括以下步骤：
[0013]1)以西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组DNA为模板，设计引物F和R进行PCR扩增，得到β
‑
半乳糖苷酶基因；
[0014]2)将β
‑
半乳糖苷酶基因与表达载体重组后转化到宿主细胞，得到重组菌株，培养重组菌株并诱导重组β
‑
半乳糖苷酶表达；
[0015]3)回收并纯化所表达的β
‑
半乳糖苷酶，得到β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13。
[0016]所述引物F和R核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。
[0017]在本专利技术的另一方面，所述耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13所具有的良好的耐盐特性，在食品工业加工中具有较好的应用潜力，具体为可用于高盐工艺来消化植物多糖、合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因。
[0018]本专利技术的有益效果为：
[0019]本专利技术所述的耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13的最适pH为6.5，在pH 6.0、pH 6.5下处理1h，其剩余酶活分别为130％、132％；最适作用温度为37℃，在37℃条件下耐受0.5h达到半衰期；该酶具有较好的NaCl稳定性，在NaCl浓度为0.5mol/L时酶活性达到最大(约2倍)。在0.5
‑
1.0mol/LNaCl浓度下可达200％以上；1.5mol/LNaCl浓度下维持190％活性；在2.0
‑
2.5mol/L浓度下均保持在130％以上；即使在3.0
‑
5.0mol/L NaCl下也能维持在65％
‑
95％。该酶的Km、和Vmax分别为4.796mmol/L和1.022mmol/min；Pb
2+
、Tween80、DTT和β
‑
巯基乙醇对其有激活作用，分别将酶活性提高25％、12％和65％、32％；Sn
2+
、Na
+
、K
+
、Fe
3+
、Mg
2+
和丙三醇对其酶活性几乎无影响。以上性质表明，本专利技术制备的耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13在食品工业(如乳制品行业)，其次，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13，其特征在于，所述β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13的编码基因，其特征在于，所述编码基因如SEQ ID NO.2所示。3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。5.权利要求1所述耐盐β
‑
半乳糖苷酶GalNC2
‑
13的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：许波，范琴，黄遵锡，吴倩，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：