一种靶向人CD133的纳米抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向人CD133的纳米抗体及其制备方法，所述方法包括以下步骤：利用稳定表达CD133的CHO细胞系作为抗原，对天然纳米抗体噬菌体展示库进行筛选，之后使用野生型CHO细胞进行负筛，获得特异性靶向人CD133的纳米抗体，将其与人IgG1Fc融合表达并纯化获得纳米抗体

【技术实现步骤摘要】
一种靶向人CD133的纳米抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于抗体制备
，涉及一种靶向人CD133的纳米抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]癌症干细胞(CSCs)是肿瘤组织中的一小群细胞，其可诱导肿瘤的起始和分化，同时介导肿瘤对化疗和放疗的抵抗性，而这被认为是诱导肿瘤复发的重要原因。因此，靶向清除肿瘤干细胞可能是治愈肿瘤的重要途径。
[0003]CD133是一个细胞表面糖蛋白分子，主要定位于细胞质膜的凸起部分，尤其是基于胆固醇的脂质微结构域，其参与膜的组织。CD133通常被作为肿瘤干细胞分离和鉴定的标志物，相比CD44和乙醛脱氢酶(ALDH)等CSC标志物，CD133具有更为局限的表达。因此，CD133长期被作为不同实体瘤中恶性祖细胞最为严格的指示物。相比CD133
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细胞，CD133
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细胞通常展现出更强的自我更新，增殖，分化和肿瘤起始能力。作为CSCs的调节蛋白，CD133可以通过多种机制调节肿瘤的发生、存活、转移和对治疗的抵抗性，这些机制如下：(1)CD133是一个胆固醇结合蛋白，通过重塑细胞膜胆固醇来诱导脂筏形成从而影响脂质代谢；(2)CD133可以通过与EGFR直接相互作用稳定EGFR，上调EGFR
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Akt信号，从而促进肿瘤增殖；(3)CD133的胞质尾可以与p85亚基发生相互作用，激活PI3K
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Akt信号，进而调节肿瘤发生；(4)CD133可通过与Src激酶的相互作用激活FAK，促进癌细胞迁移和转移；(5)CD133可从细胞膜释放进入胞质，诱导自噬小体的形成，促进肿瘤细胞在营养受限等不利条件下的存活；(6)CD133诱导的脂滴形成可以上调促进肿瘤发生的Wnt/β
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catenin信号；(7)CD133可以上调GSH水平使CD133
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细胞对活性氧应激产生抵抗，从而对化疗药物产生耐受性；综上所述，CD133调节着CSCs在肿瘤发生、发展、转移和药物抵抗中的方方面面，有望成为肿瘤靶向治疗的潜在靶点，为肿瘤的治愈带来新的希望。
[0004]抗体药物偶联物是结合了抗体高度特异性和小分子药物细胞毒作用两种属性的新型药物，可以更低的给药剂量实现更好的肿瘤治疗效果，在肿瘤的靶向治疗中展现出了非常广阔的前景。因此，开发靶向CD133的抗体药物偶联物对肿瘤干细胞进行定向清除有望解决当前肿瘤治疗中面临的药物抵抗和复发难题，为复发和难治性肿瘤的治疗提供新的途径。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种靶向人CD133的纳米抗体、制备方法及其与DM1偶联物的制备，对CD133
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细胞具有细胞毒作用。
[0006]本专利技术提供了一种靶向人CD133的单峰驼纳米抗体，所述纳米抗体的碱基序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；所述纳米抗体的碱基序列SEQ ID NO.1～2和氨基酸序列SEQ ID NO.3～4均包含可变区。
[0007]所述纳米抗体为1G6、2C3。
[0008]所述纳米抗体为1)或2)所述的蛋白质：
[0009]1)含有可变区的如SEQ ID NO.1～2所示的碱基序列编码翻译，或如SEQ ID NO.3～4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010]2)将如SEQ ID NO.1～2所示碱基序列或如SEQ ID NO.3～4所示的氨基酸序列中的可变区经过一个或几个碱基/氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，获得的具有与1)中蛋白质相同功能的由1)衍生的蛋白质。
[0011]本专利技术还提供了一种编码所述纳米抗体的编码DNA，所述编码DNA序列为如下1)
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3)中任一所述：
[0012]1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2中可变区所示的核苷酸序列；
[0013]2)与SEQ ID NO.1或2中序列限定的DNA分子杂交且编码所述纳米抗体的DNA序列；
[0014]3)与1)的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述纳米抗体的DNA序列。
[0015]本专利技术还提供了一种含有上述纳米抗体的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌。
[0016]本专利技术还提供了上述靶向人CD133的单峰驼纳米抗体或重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌在a)
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c)中任一种中的应用：
[0017]a)制备特异性结合人CD133的细胞治疗产品；
[0018]b)制备治疗肿瘤的抗体药物、靶向人CD133的免疫毒素、抗体药物偶联物产品；
[0019]c)制备治疗肿瘤的细胞治疗产品。
[0020]本专利技术还提供了一种靶向人CD133纳米抗体的制备方法，利用稳定表达CD133的CHO细胞系作为抗原，对天然纳米抗体噬菌体展示库进行筛选，之后使用野生型CHO细胞进行负筛，所述方法具体包括如下步骤：
[0021]1)利用分子克隆的方法构建CD133全长的慢病毒包装质粒，与PsPAX2和pMD2G共转染HEK293T细胞，获取慢病毒上清；经离心去除细胞碎片后，使用超滤管对慢病毒上清进行浓缩，得到慢病毒浓缩液；采用流式细胞术对慢病毒滴度进行检测；
[0022]2)将制备好的CD133慢病毒浓缩液感染CHO细胞；
[0023]3)根据细胞是否携带绿色荧光蛋白eGFP以及eGFP的荧光强弱对感染后CHO细胞进行流式分选，得到CD133高表达的细胞亚群，随后使用流式细胞术检测细胞表面CD133的表达水平，设置天然高表达CD133的阳性细胞对照；
[0024]4)以经过验证的CD133稳定表达的CHO细胞作为抗原为高容量天然纳米抗体噬菌体展示库进行正筛，洗脱获得候选噬菌体；使用野生型CHO细胞对候选噬菌体进行负筛，去除与非靶蛋白结合的噬菌体颗粒；
[0025]5)重复进行步骤4)，使噬菌体展示库中与靶蛋白结合的噬菌体克隆得到富集；
[0026]6)根据筛选富集情况，利用具有富集倾向的候选噬菌体侵染对数期大肠杆菌TG1菌株，分别以稳定表达CD133的CHO细胞和野生型CHO细胞作为抗原进行单克隆噬菌体ELISA筛选，获取结合CD133稳定表达CHO细胞而不结合野生型CHO细胞的克隆；
[0027]7)对获取的候选克隆进行测序和比对分析，明确得到的候选抗体的核苷酸和氨基酸序列数目；
[0028]8)根据获得的序列数目对候选纳米抗体进行原核表达和纯化；将包含候选纳米抗体编码序列的阳性克隆噬菌粒载体转化BL21(DE3)，使用1mM IPTG对候选纳米抗体进行诱
导表达，随后通过渗透压冲击法提取周质，使用Ni
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NTA层析柱进行亲和纯化，得到具有高纯度的纳米抗体。
[0029]9)特异性和种属交叉反应性检测；使用流式细胞术以纯化获得的纳米抗体对天然表达CD133本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向人CD133的单峰驼纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的碱基序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；所述纳米抗体的碱基序列SEQ ID NO.1～2和氨基酸序列SEQ ID NO.3～4均包含可变区。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗体为1)或2)所述的蛋白质：1)含有可变区的如SEQ ID NO.1～2所示的碱基序列编码翻译，和/或如SEQ ID NO.3～4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将如SEQ ID NO.1～2所示碱基序列或如SEQ ID NO.3～4所示的氨基酸序列中的可变区经过一个或几个碱基/氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，获得的具有与1)中蛋白质相同功能的由1)衍生的蛋白质。3.一种编码如权利要求1或2所述的纳米抗体的编码DNA。4.根据权利要求3所述的编码DNA，其特征在于，所述编码DNA为如下1)
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3)中任一所述：1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2中可变区所示的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2中序列限定的DNA分子杂交且编码如权利要求1或2中任一所述抗体的DNA序列；3)与1)的DNA序列具有90％以上的同源性且编码如权利要求1或2中所述的抗体的DNA序列。5.一种含有如权利要求1或2所述的纳米抗体的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌。6.一种靶向人CD133的单峰驼纳米抗体制备方法，其特征在于，利用稳定表达CD133的CHO细胞系作为抗原，对天然纳米抗体噬菌体展示库进行筛选，随后使用野生型CHO细胞进行负筛，所述方法具体包括以下步骤：1)利用分子克隆方法构建人CD133全长的慢病毒包装质粒，与PsPAX2和pMD2G共转染HEK293T细胞，获得慢病毒上清；经离心去除细胞碎片后，使用超滤管对慢病毒上清进行浓缩，得到慢病毒浓缩液；采用流式细胞术对慢病毒滴度进行检测；2)将所述步骤1)制备好的CD133慢病毒浓缩液感染CHO细胞；3)根据细胞是否携带绿色荧光蛋白eGFP以及eGFP的荧光强弱对所述步骤2)感染后CHO细胞进行流式分选，得到CD133高表达的细胞亚群，随后使用流式细胞术检测细胞表面CD133的表达水平，设置天然高表达CD133的阳性细胞对照；4)以经过验证的CD133稳定表达的CHO细胞作为抗原为高容量天然纳米抗体噬菌体展示库进行正筛，洗脱获得候选噬菌体；使用野生型CHO细胞对候选噬菌体进行负筛，去除与非靶蛋白结合的噬菌体颗粒；5)重复进行步骤4)，使噬菌体展示库中与靶蛋白结合的噬菌体克隆得到富集；6)根据筛选...

【专利技术属性】
技术研发人员：任华，符智祥，钱旻，何苗壮，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：