大豆基因启动子pRPS28和pRPS28-I在大豆、拟南芥及烟草中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及大豆基因启动子pRPS28和pRPS28

【技术实现步骤摘要】
大豆基因启动子pRPS28和pRPS28
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I在大豆、拟南芥及烟草中的应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及大豆基因启动子pRPS28和pRPS28
‑
I在大豆、拟南芥及烟草中的应用。

技术介绍

[0002]启动子是调控植物基因表达的重要组成部分。按照来源，启动子可以分为外源启动子和内源启动子。外源启动子可以异源调控基因的表达，但是在制备转基因材料时往往会出现转基因安全问题，尤其是常用的来源于病毒的启动子，如烟草花叶病毒35S启动子。此外，在同一个转基因事件中使用同一个启动子还有可能发生转基因沉默现象。因此，内源启动子是制备转基因材料更加受到青睐的启动子。按照表达特征，启动子分为组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子等。其中组成型启动子调控的表达不受组织特异性、时空等的影响。在制备一些转基因材料时，组成型启动子驱动的基因表达会更加稳定。
[0003]大豆是重要的油料作物和蛋白质作物，并且能够与根瘤菌共生，形成根瘤，将空气中的氮气转化为可供植物利用的氨。通过根瘤固氮，大豆不但可以为自己提供氮源，还可以通过间作、轮作的方式为其他作物提供氮源，进而减少化肥施用，建立绿色生态型农业系统。但是大豆的产量一直很低，通过转基因手段获得性状优良、产量高的大豆品种是未来大豆研究的重要方向之一。除了外源的病毒启动子，如35S启动子、CMV启动子等用于大豆的转化外，一些内源启动子也被陆续报道，这些内源启动子包括高表达和泛表达的组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子等，其中组成型启动子是指在生长发育的不同阶段、不同组织、不同生长条件都能够驱动基因稳定表达的启动子。
[0004]已经报道的大豆中组成型启动子中，Gmubi启动子由于较高的表达量使其成为目前应用比较广泛的启动子。此外，在筛选手段方面，已经报道的组成型启动子的筛选条件大都不完善，大部分启动子都是根据大豆生长发育的单一时期的组织表达得到的，而在大豆根瘤发育过程中组成型表达的启动子几乎没有报道。在筛选技术上，大部分报道的启动子是通过传统的qRT
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PCR方法检测的，通过高通量的RNA测序方法检测表达水平的报道并不多。文献（Ning Zhang,Leah K. McHale,John J. Finer. Isolation and characterization of
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GmScream
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promoters that regulate highly expressing soybean (Glycine max Merr.) genes[J]. Plant Science,2015,241.）根据来源于大豆品系Williams82（WS82）的31个文库的RNA测序数据筛选到了10个可能的组成型启动子的表达基因，但是其中并没有涉及一个大豆生长发育的连续过程及根瘤发育中的表达情况。同时，在同一株植物中转入多个基因时，如果用同一个启动子驱动容易造成基因沉默。
[0005]因此，开发在大豆不同发育时期和组织及根瘤发育过程中泛表达的启动子对大豆转基因工程的应用非常重要。

技术实现思路

本专利技术的目的在于获得用于分析大豆生长发育不同时期、不同组织中表达情况，及根瘤发育情况的内参基因RPS28和EIF1，并同时获得其启动子pRPS28和pEIF1。
[0006]本专利技术的另一个目的是提供启动子pRPS28、启动子pEIF1在调控大豆基因或其他植物（例如烟草、拟南芥）基因的组成型、或者非组织特异性表达中的应用，具体为实现全长型启动子pRPS28及内含子存在型启动子pRPS28
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I，全长型启动子pEIF1及内含子存在型启动子pEIF1
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I分别驱动目的基因在大豆、拟南芥、烟草中的高表达和泛表达。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术首先提供了大豆基因启动子在外源基因表达中的应用。
[0008]所述启动子包括全长型启动子pRPS28或内含子存在型启动子pRPS28
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I，全长型启动子pEIF1或内含子存在型启动子pEIF1
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I，所述启动子作为泛表达启动子，用于驱动外源基因表达。
[0009]所述外源基因为GUS基因。
[0010]上述大豆基因启动子在用于大豆基因表达时，能够驱动外源基因在大豆子叶、胚根、胚芽、真叶、复叶、芽、叶柄、节间、根和根瘤中表达。
[0011]上述大豆基因启动子在用于拟南芥基因表达时，能够驱动外源基因在拟南芥全株、花、荚果中表达。
[0012]上述大豆基因启动子在用于烟草基因表达时，能够驱动外源基因在烟草叶片中表达。
[0013]进一步的，本专利技术还提供了一种含有大豆基因启动子的重组载体。
[0014]所述重组载体在构建时，将大豆基因启动子重组进入载体pCAMBIA1391Z
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BAR中构建获得，具体步骤如下：以pRPS28、pRPS28
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I、pEIF1、pEIF1
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I的PCR扩增片段为模板，并将PCR扩增片段克隆进大豆稳定转化载体pCAMBIA1391Z
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BAR中，获得大豆稳定转化载体pRPS28
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GUS
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BAR、pRPS28
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I
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GUS
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BAR、pEIF1
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GUS
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BAR、pEIF1
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I
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GUS
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BAR。
[0015]进一步的，本专利技术还提供了PCR扩增大豆RPS28基因和EIF1基因用引物对。
[0016]具体为，扩增RPS28的引物：RPS28
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F：ATGGAGTCTCAGGTGAAGCACRPS28
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R：CTAGCGCAATCTTCTTGCTTC扩增EIF1的引物：EIF1
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F：ATGTCTGAATTAGACGATCAAATTCCEIF1
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R：TCAGAAACCATGAATCTTGATATGATC。
[0017]进一步的，本专利技术还提供了PCR扩增大豆基因启动子的引物对。
[0018]构建pRPS28
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GUS表达载体所用引物为：pRPS28
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GUS
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bar
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F：GACCATGATTACGCCAAGCTTCACCACCCAATCCATAACCACCACpRPS28
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GUS
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bar
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R：CCAGTGAATTCCCGGGGATCCCTGATGCAAAACACGAACAAAGAAAG构建pRPS28
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I
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GUS表达载体所用引物为：pRPS28
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大豆基因启动子在外源基因表达中的应用，其特征在于，所述启动子为全长型启动子pRPS28或内含子存在型启动子pRPS28
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I，作为泛表达启动子，用于驱动外源基因表达。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外源基因为GUS基因。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，用于大豆时，能够驱动外源基因在大豆子叶、胚根、胚芽、真叶、复叶、芽、叶柄、节间、根和根瘤中表达。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，用于拟南芥时，能够驱动外源基因在拟南芥全株、花、荚果中表达。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，用于烟草时，能够驱动外源基因在烟草叶片中表达。6.含有大豆基因启动子的重组载体，其特征在于，将大豆基因启动子重组进入载体pCAMBIA1391Z
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BAR中构建获得，具体步骤如下：以pRPS28、pRPS28
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I的PCR扩增片段为模板，并将PCR扩增片段通过无缝克隆法克隆进大豆稳定转化载体pCAMBIA1391Z
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BAR中，获得大豆稳定转化载体pRPS28
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GUS
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BAR、pRPS28
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I
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GUS
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BAR。7.PCR扩增大豆基因启动子的引物对，其特征在于，构建pRPS28
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GUS表达载体所用引物为：pRPS28
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GUS
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bar
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【专利技术属性】
技术研发人员：王学路，王海娇，彭亚齐，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：