一种筛选幽门螺杆菌脲酶抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器筛选幽门螺杆菌脲酶抑制剂的方法，步骤包括1)HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器的制备及表征；2)以HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器检测0～100mM梯度浓度尿素产生的响应电流，根据米氏方程计算得到该生物传感器检测尿素的K

【技术实现步骤摘要】
一种筛选幽门螺杆菌脲酶抑制剂的方法


[0001]本专利技术涉及一种筛选幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)脲酶抑制剂的方法，尤其涉及一种利用H.pylori脲酶b亚基(H.pylori 26695urease b subunit，HPUb)/纳米铂(Nano platinum，nPt)/纳米多孔金(Nanoporous gold，NPG)/玻碳电极(Glassy carbon electrode，GCE)生物传感器筛选幽门螺杆菌脲酶抑制剂的方法。属于电化学分析测试领域。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌(H.pylori)是一种选择性地定殖在人胃黏膜上皮细胞表面和胃粘液底层的革兰氏阴性微需氧细菌。众所周知，H.pylori与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤和胃腺癌的发生有关。尽管基于抗生素、质子泵抑制剂和铋剂的联合疗法仍有效，但是随着耐药性以惊人的速度增加，这些传统疗法对H.pylori的根除率在全世界范围内不断下降。因此，需要寻找新的治疗靶点并开发潜在的治疗药物。
[0003]H.pylori能够在胃的恶劣环境中存活主要依赖于其独特的适应性机制，其中最重要的是具有强大活性的毒力因子脲酶。脲酶不仅是H.pylori存活和初始定植的关键，而且是维持慢性感染所必需的。作为开发新药的策略，脲酶抑制已被证明是有前途的。然而，目前脲酶抑制剂筛选试验主要基于植物脲酶，但植物和H.pylori脲酶的性质差异阻碍了这些努力。因此，迄今为止，只有乙酰氧肟酸(acetohydroxamic acid，AHA)被开发用于在临床上抑制H.pylori脲酶活性。不幸的是，AHA在多数患者身上表现出的明显的严重副作用限制了它的应用发展。此外，现有的筛选方法几乎都是基于细菌培养和苯酚
‑
次氯酸盐比色法。这些方法还不能满足快速药物筛选的需求。因此，亟需开发更加高效快速的H.pylori脲酶抑制剂筛选技术。生物传感器作为一种兼具生物、化学、电学等多学科的技术，具有快速、准确、高灵敏度和低检测限等优点。然而，目前脲酶相关的生物传感器都是用于尿素、重金属离子和农药的检测。基于生物传感器技术筛选幽门螺杆菌脲酶抑制剂的研究及其专业方法仍是空白。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种利用HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器筛选幽门螺杆菌(H.pylori)脲酶抑制剂的方法。
[0005]为了有效筛选H.pylori脲酶抑制剂，本专利技术采用HPUb作为识别基团，然后将其固定于nPt/NPG/GCE制成生物传感器，基于HPUb对尿素的特异性催化和nPt电催化氧化NH3的能力实现了对H.pylori脲酶抑制剂的筛选。其检测原理为尿素被HPUb催化水解产生CO2和NH3，随后电极表面的nPt电催化氧化NH3生成N2；与此同时，NH3被氧化失去的电子被电极捕获从而显示出NH3的氧化峰。因此，NH3的氧化峰电流值与尿素浓度之间具有正相关关系，通过检测梯度浓度尿素分别对应的NH3氧化峰电流可以根据米氏方程计算得到该生物传感器检测尿素溶液的反应常数(K
a，尿素
)和最大反应速率(V
max，尿素
)。当脲酶抑制剂存在时其可以与
HPUb结合从而抑制HPUb水解尿素的反应，通过测量梯度浓度尿素
‑
脲酶抑制剂混合溶液的NH3氧化峰电流并根据米氏方程计算混合溶液中脲酶抑制剂存在下该生物传感器检测尿素
‑
脲酶抑制剂混合溶液的反应常数(K
a，尿素
‑
抑制剂
)和最大反应速率(V
max，尿素
‑
抑制剂
)，并根据酶的抑制理论，当K
a，尿素
‑
抑制剂
显著大于K
a，尿素
，V
max，尿素
‑
抑制剂
与V
max，尿素
没有显著差异时即可判定为竞争性抑制；当K
a，尿素
‑
抑制剂
与K
a，尿素
没有显著差异，V
max，尿素
‑
抑制剂
显著小于V
max，尿素
时即可判定为非竞争性抑制；当K
a，尿素
‑
抑制剂
显著小于K
a，尿素
，V
max，尿素
‑
抑制剂
显著小于V
max，尿素
，同时V
max，尿素
‑
抑制剂
与K
a，尿素
‑
抑制剂
的比值和V
max，尿素
与K
a，尿素
的比值没有显著差异时即可判定为反竞争性抑制。此外，根据尿素
‑
脲酶抑制剂混合溶液的反应动力学双倒数曲线的斜率与尿素溶液的反应动力学双倒数曲线的斜率的比值可以计算出抑制剂的抑制常数(K
i
)。
[0006]本专利技术所述筛选幽门螺杆菌脲酶抑制剂的方法，具体步骤是：
[0007](1)HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器的制备与表征；
[0008]其中，所述生物传感器的制备方法是：将通过40℃浓硝酸腐蚀Au/Ag合金片1h后制备的纳米多孔金(NPG)薄膜贴附在预处理玻碳电极(GCE)上；随后采用计时电流法将纳米铂(nPt)电沉积在NPG/GCE表面获得nPt/NPG/GCE；最后在该nPt/NPG/GCE表面滴涂纯化的幽门螺杆菌脲酶b亚基(HPUb)，并在4℃自组装24
±
2h；最终获得HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器；
[0009](2)以HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器检测0～100mM梯度浓度尿素产生的响应电流，根据米氏方程计算得到该生物传感器检测尿素的K
a，尿素
和V
max，尿素
；
[0010](3)检测不同脲酶抑制剂筛选分析各个抑制剂的抑制类型和/或抑制常数K
i
；
[0011]其特征在于：
[0012]步骤(1)所述HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器的制备方法中，在将nPt电沉积在NPG/GCE表面时采用阴极还原电镀法，其中沉积电解液为含5mM H2PtCl6的0.5mol/L H2SO4溶液，电流密度为3～7mA/cm2，电沉积时间为90～150s；同时，采用配备有能量色散X射线光谱仪的扫描电子显微镜观察nPt/NPG的微观形态和元素组成；
[0013]步骤(1)所述HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器的表征方法是：以制得的HPUb/nPt/NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系在含0.2mol/L KNO3的1
×
10
‑3mol/L K3Fe(CN)6溶液中通过CV法表征本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选幽门螺杆菌脲酶抑制剂的方法，步骤是：(1)HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器的制备与表征；其中，所述生物传感器的制备方法是：将通过40℃浓硝酸腐蚀Au/Ag合金片1h后制备的纳米多孔金(NPG)薄膜贴附在预处理玻碳电极(GCE)上；随后采用计时电流法将纳米铂(nPt)电沉积在NPG/GCE表面获得nPt/NPG/GCE；最后在该nPt/NPG/GCE表面滴涂纯化的幽门螺杆菌脲酶b亚基(HPUb)，并在4℃自组装24
±
2h；最终获得HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器；(2)以HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器检测0～100mM梯度浓度尿素产生的响应电流，根据米氏方程计算得到该生物传感器检测尿素的K
a，尿素
和V
max，尿素
；(3)检测不同脲酶抑制剂筛选分析各个抑制剂的抑制类型和/或抑制常数K
i
；其特征在于：步骤(1)所述HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器的制备方法中，在将nPt电沉积在NPG/GCE表面时采用阴极还原电镀法，其中沉积电解液为含5mM H2PtCl6的0.5mol/L H2SO4溶液，电流密度为3～7mA/cm2，电沉积时间为90～150s；同时，采用配备有能量色散X射线光谱仪的扫描电子显微镜观察nPt/NPG的微观形态和元素组成；步骤(1)所述HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器的表征方法是：以制得的HPUb/nPt/NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系在含0.2mol/L KNO3的1
×
10
‑3mol/L K3Fe(CN)6溶液中通过CV法表征各个电极修饰步骤，其中电压范围为
‑
0.4～0.8V，扫描速率为25～100mV/s，共扫描3～10圈；步骤(2)所述以HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器检测0～100mM梯度浓度尿素产生的响应电流，根据米氏方程计算得到该生物传感器检测尿素的K
a，尿素
和V
max，尿素
的方法是：以制得的HPUb/nPt/NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在
‑
1.2～1.4V的电压范围内以及25～100mV/s的扫描速率下通过CV法测量0～100mM梯度浓度尿素的响应电流；50mM pH 8.0的PBS被用作测试底液；将NH3的氧化峰电流作为测量响应电流；响应电流变化率作为检测指标，其计算公式如等式(1)所示：其中，I0和I1分别表示检测空白底液和尿素溶液的稳态电流值；随后以尿素浓度的倒数对响应电流变化率的倒数通过Lineweaver
‑
Burk作图法得到双倒数曲线并对曲线进行线性拟合；在酶促反应动力学的Lineweaver
‑
Burk图中，K
a
和V
max
与双倒数曲线的线性回归方程的斜率和截距之间的关系如公式(2)和(3)所示：的斜率和截距之间的关系如公式(2)和(3)所示：根据公式(2)和(3)以及该生物传感器检测尿素的双倒数曲线拟合线性回归方程即可计算得到该生物传感器检测尿素的K
a，尿素
和V
max，尿素
；步骤(3)所述检测不同脲酶抑制剂筛选分析各个抑制剂的抑制类型和/或抑制常数K
i
的方法是：
基于步骤(2)得到的该生物传感器检测尿素的K
a，尿素
，确定3～5倍K
a，尿素
作为脲酶抑制剂的测试浓度；通过在0～1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王霞，肖洒，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：