N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量方法技术

本发明专利技术属于分析化学技术领域，具体为N

【技术实现步骤摘要】
N
‑
糖肽末端唾液酸
α
2,6和
α
2,3连接异构相对定量方法


[0001]本专利技术属于分析化学
，具体涉及N
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量方法。

技术介绍

[0002]糖基化是生物体中广泛存在的一种重要蛋白质翻译后修饰(PTM)，对其蛋白质的化学和生物学特性有非常重要的影响。在人类糖蛋白上，唾液酸是一种酸性九碳糖家族，它通过α2,3
‑
或α2,6糖苷键连接在半乳糖(Gal)残基上，它既可以作为附着蛋白的调节因子，也可以作为其他糖蛋白的识别靶点，从而调节各种生理和病理过程。唾液酸连接异构的分析方法多种多样，传统的谱学方法主要包括核磁共振法与红外吸收光谱法，这两类方法都通过不同连接唾液酸的谱学特征对其进行区分；
①
基于核磁共振法，可以通过对各元素的谱图进行解析，从而推断所分析糖链的完整结构；但其缺点在于，不能实现定量分析，同时需要相对大量且高纯度的样品；
②
糖链的红外吸收光谱则一般难以直接进行解析，需要与标准样品进行比对来确认其相应结构。这一方法虽然对样品量要求低，但对样品纯度却有较高的要求；同时，该方法对复杂糖链的结构解析较难。除此之外，凝集素也被用于唾液酸连接异构的分析。常用的凝集素中，怀槐凝集素(MAL I)选择性识别α2,3
‑
连接唾液酸，而大豆凝集素(SNA)选择性识别α2,6
‑
连接唾液酸。凝集素方法能够快捷用于分析某个样品中不同连接唾液酸的含量，并在样品间进行半定量对比，但无法精确获得位点、糖型及其结构信息，灵敏度方面表现也有所欠缺。尽管目前基于质谱(MS)的唾液酸化α2,3
‑
/α2,6
‑
连接N
‑
聚糖链异构的鉴定和定量已经得到了迅速发展，但N
‑
糖肽唾液酸α2,3/α2,6连接异构分离分析在技术上仍然非常具有挑战性。据报道，糖肽的唾液酸α2,3
‑
/α2,6
‑
连接异构在串级质谱中几种特征碎片的相对强度会存在差异，可通过计算来推算母离子中唾液酸的连接情况。但这一方法无法用于糖肽唾液酸α2,3
‑
/α2,6
‑
连接异构的定量分析。在高柱温情况下的PGC分离与反相色谱分离也能实现部分糖肽唾液酸连接异构的分离，但对于复杂的多糖肽样本分析受限。因此对于复杂N
‑
糖肽末端唾液酸α2,3/α2,6连接异构的相对定量分析缺乏方便、快捷、环境友好的定量方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是针对目前完整N
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糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构体相对定量方法匮乏的现状，提供一种高通量、高效、准确的完整N
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构体相对定量方法。
[0004]本专利技术使用液相分离和离子淌度质谱气相分级技术相结合的方法对完整N
‑
糖肽进行处理，对特定完整N
‑
糖肽离子在特定液相色谱保留时间与特定m/z下进行母离子的选择，并在质谱碰撞池内进行碰撞诱导解离（CID），采用无动态排除的数据依赖性质谱扫描模式进行质谱数据采集，实现对目标母离子的全采集；完成质谱数据采集后，将归属于该完整N
‑
糖肽的末端唾液酸α2,6和α2,3异构体B
3+
碎片的淌度到达时间分布（ATDs）面积进行比较，
从而实现不同完整N
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构体的相对定量。具体步骤为：（1）将蛋白质样品的酶解富集后的N
‑
完整糖肽进行分离，以降低样本中N
‑
糖肽的复杂程度；这里，所述对N
‑
完整糖肽进行分离，可以采用反相液相色谱法、亲水液相色谱法、离子交换液相色谱法、疏水液相色谱法或毛细管电泳法进行分离；（2）将分离后的N
‑
糖肽进行质谱气相分离和质谱检测；其中，所述质谱气相分离，具体包括：1）母离子选择：将母离子在特定色谱分级保留时间，根据特定m/z下以
±
2Da为窗口进行气相下的母离子的选择；2）质谱采集，针对上述选择的目标完整N
‑
糖肽母离子，以15～50eV碎裂能量进行碎裂，并将碎裂的全部离子再送入离子淌度质谱离子淌度漂移管进行分离分析，其中质谱的采集模式设置为HD
‑
MS/MS模式；最终对离子淌度分离后的碎片离子信号进行质谱数据的采集；这里，所述质谱检测采用的质谱仪为四极杆质谱仪、离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪与离子淌度质谱仪的一种或多种组合；（3）完成质谱数据采集后，将归属于同一完整N
‑
糖肽的末端唾液酸α2,6和α2,3异构体B
3+
碎片（[NeuAcα2
‑
3/α2
‑
6Galβ1
‑
4GlcNAc]+, m/z 657.24）的淌度到达时间分布（ATDs）面积进行比较，得到α2,6和α2,3异构体B
3+
碎片的相对定量比值，从而实现了N
‑
完整糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构的相对定量。
[0005]本专利技术提供的方法能够用于不同生理或病理状态下的不同生物体蛋白质样本，包括组织、细胞、不同亚细胞器、体液中完整N
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量。
[0006]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：（1）基于液相分离和质谱分级联用技术，实现N
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构的相对定量。可以高通量、高效、准确的进行N
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糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构的相对定量；（2）定量准确度高。基于目标完整N
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糖肽的碎片全淌度扫描，能够采集所有碎片离子的淌度分离，针对完整N
‑
糖肽的末端唾液酸α2,6和α2,3异构体B
3+
碎片（[NeuAcα2
‑
3/α2
‑
6Galβ1
‑
4GlcNAc]+, m/z 657.24）的淌度到达时间分布（ATDs）进行定量分析；（3）环境优化，无需化学反应，具有更高的准确性。
附图说明
[0007]图1为本专利技术基于液相分离和离子淌度质谱气相分级技术相结合，实现N
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构连接的相对定量工作流程图。
[0008]图2为本专利技术中不同比例标准N
‑
糖肽α2,3
‑
SGP和α2,6
‑
SGP对应的B
3+
碎片淌度分离后的淌度到达时间分布图。
[0009]图3为本专利技术中标准N
‑
糖肽α2,3
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N
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糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量方法，其特征在于，使用液相分离和离子淌度质谱气相分级技术相结合的方法对完整N
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糖肽进行处理，对特定完整N
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糖肽离子在特定液相色谱保留时间与特定m/z下进行母离子的选择，并在质谱碰撞池内进行碰撞诱导解离，采用无动态排除的数据依赖性质谱扫描模式进行质谱数据采集，实现对目标母离子的全采集；完成质谱数据采集后，将归属于该完整N
‑
糖肽的末端唾液酸α2,6和α2,3异构体B
3+
碎片的淌度到达时间分布面积进行比较，从而实现不同完整N
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构体的相对定量；具体步骤为：（1）将蛋白质样品的酶解富集后的N
‑
完整糖肽进行分离，以降低样本中N
‑
糖肽的复杂程度；（2）将分离后的N
‑
糖肽进行质谱气相分离和质谱检测；所述质谱气相分离具体包括：1）母离子选择：将母离子在特定色谱分级保留时间，根据特定m/z下以
±
2Da为窗口进行气相下的母离子的选择；2）质谱采集，针对上述选择的目标完整N
‑
糖肽母离子，以15～50eV碎裂能量进行碎裂，并将碎裂的全部离子再送入离子淌度质谱离子淌度漂移管进行分离分析，其中质谱的采集模式设置为HD
‑
MS/MS模式；最终对离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏黎明，封晓晓，陆豪杰，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：