ssDNA核酸适配体在识别大口黑鲈虹彩病毒感染细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种ssDNA核酸适配体及其在识别大口黑鲈虹彩病毒感染细胞中的应用，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5

【技术实现步骤摘要】
ssDNA核酸适配体在识别大口黑鲈虹彩病毒感染细胞中的应用


[0001]本专利技术涉及一种ssDNA核酸适配体及其应用，特别是涉及一种ssDNA核酸适配在识别大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞中的应用。

技术介绍

[0002]大口黑鲈(Micropterus salmoides)是一种纯淡水的广温性肉食性名贵鱼类，其原产于北美洲密西西比河流域,于1983年初引入我国，经过试养与人工繁殖，获得成功，成为我国重要的淡水养殖鱼类之一。据不完全统计，目前中国大口黑鲈的年产量已达到16万吨。大口黑鲈具有适应性强、生长迅速、起捕容易、养殖周期短等优点，加之肉质鲜美、营养丰富、无肌间刺、外形美观，因而深受广大养殖者和消费者们的喜欢。
[0003]由病毒感染引起的大口黑鲈疾病死亡率高,且难以防治,对世界范围内的大口黑鲈养殖业带来了较为严重的威胁。大口黑鲈病毒性疾病主要有虹彩病毒导致的溃疡病、脾肾坏死病等。大口黑鲈在被虹彩病毒感染后，体表会有斑块状出血性溃疡，尾柄红肿溃疡，病鱼肝脏肿大、颜色发白或发黄。
[0004]对于水产疫病的防控应坚持“以防为主，防治结合”的原则。病害防控的核心在于深入研究病原侵染致病的分子机理，同时针对病原发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的快速检测技术及快检试剂盒，加强养殖过程中对病害的监测，结合使用高效的抗病药物，达到及时干预、降低病原暴发几率的目的。目前我国科研人员已针对大口黑鲈虹彩病毒研发出多种检测技术，包括基于分子生物学的聚合酶链式反应技术(PCR)和环介导等温扩增技术(LAMP)，以及基于抗体的免疫检测技术等，部分产品的可操作性和技术水平等均达到较高水平。其中PCR技术基于其高灵敏度和高精确度，是目前实验室中最常用的检测病原技术，但是PCR技术存在操作繁琐、仪器昂贵、检测耗时长，以及试剂保存条件苛刻等种种不足，导致其仅适用于专业技术人员在实验室条件下对少量样品的检测，无法满足大口黑鲈养殖过程中对LMBV病毒进行现场高通量快速检测的需要。基于抗体的免疫学检测技术具有一些不足，例如抗体需要严格的低温保存条件，抗体制备耗时长、费用高、批次间质量存在差异，对结构类似化合物有一定程度的交叉反应易导致“假阳性”结果。
[0005]因此应着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高、可用于养殖现场的大口黑鲈LMBV病毒快速检测技术和功能产品，这对于及早发现、确定病原，进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失至关重要。
[0006]指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment technology,SELEX)是一种生物文库筛选技术，是基于分子生物学的认识：核酸分子与蛋白质分子等在体内的特异性相互作用，是基因转录、核酸复制、蛋白表达等一系列基本生命活动有序进行的保证。SELEX技术的基本原理：人工合成单链核酸文库(单链DNA或RNA)，文库含40nt左右的随机序列，其可能的序列理论上可达4
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种。一级序列的多样性，也导致了单链DNA或RNA二级和三级结构的多样性。这些不同序列与不同空间
结构的核酸，经过多个循环的筛选，多种靶物质，如蛋白质、核酸、小肽和氨基酸等有机分子，甚至金属离子，在理论上都可以找到与之特异并稳固结合的核酸序列。经过多轮循环筛选及PCR/RT
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PCR技术的扩增，再经克隆测序鉴定，进而可以大量生产并纯化得到与靶物质结合的这一段特异序列的核酸链
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配基，也称核酸适配子或适配体。
[0007]核酸适配体能够特异性与靶物质牢固结合，因而可以在很大程度上相当于抗体的作用，而且在一些抗体还无法应用的领域也能发挥作用。适配子可以作为诊断试剂，单独或与抗体组合应用于多种诊断模式，还可以应用于临床治疗等。
[0008]核酸适配体具有易筛选、易修饰、稳定性强、高特异性识别靶标分子等优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具。首先，SELEX技术筛选周期短，通常核酸适配体的筛选需要6
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30个SELEX循环，约3
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8周的时间。而针对靶标分子筛选、制备特异性的生物抗体等则需要长达3
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8个月的时间，且抗体存在成本高、易失活、保存条件苛刻、批次间的抗体质量存在差异等问题。其次，SELEX技术是在体外进行的化学筛选过程，因此靶标分子范围广范从金属离子、有机染料等简单体系，到病毒、细胞、组织等复杂体系，均可作为SELEX筛选的靶标分子，特别是具有细胞毒性、无免疫原性或者免疫原性弱的靶标分子，均能够使用SELEX技术在体外进行高特异性核酸适配体的筛选。因此，核酸适配体的研究日益受到国内外生物化学、生物医学、纳米材料、蛋白质科学等多学科研究者的广泛关注。目前，核酸适配体已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。

技术实现思路

[0009]本专利技术在于提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、且稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞的核酸适配体，以至少解决现有的生物学检测技术不能在现场快速对大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞进行准确检测的问题。
[0010]本专利技术的目地在于提供一种可特异性识别、检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为5
’‑
GGCGGTCCCGATGGCGAGCAAGCCAATAACCCCCC ATGCACATCGTTAGT
‑3’
(SEQ ID NO：1)。
[0011]进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列为5
’‑
GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGGGC GGTCCCGATGGCGAGCAAGCCAATAACCCCCCATGCACATCGTTAGTCGAAGGACGCAGAT GAAGTCTC
‑3’
(SEQ ID NO：2)。
[0012]更进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。
[0013]更进一步地，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。
[0014]更进一步地，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、羟基荧光素(6
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carboxy
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fluorescein,FAM)、CY5荧光素(CY5 fluorescent dye)、CY3荧光素(CY3 fluorescent dye)、羧基四甲基罗丹明(Carboxytetramethylrhodamine,TAMRA)等荧光物质或发光材料、荧光淬灭剂(Black Hole Quencher,BHQ)中的一种或多种。
[0015]本专利技术还有一目地在于提供一种基于核酸适配体的用于致病性大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞快速检测的荧光分子探针(Aptam本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于识别、检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5
’‑
GGCGGTCCCGATGGCGAGCAAGCCAATAACCCCCCATGCACATCGTTAGT
‑3’
。2.一种用于识别、检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5
’‑
GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGGGCGGTCCCGATGGCGAGCAAGCCAATAACCCCCCATGCACATCGTTAGTCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
‑3’
。3.根据权利要求1或2所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。4.根据权利要求3述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述标记物选...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏飞，余庆，刘明珠，苏美珍，卓晓菲，王浩，王高学，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：