水牛奶特征肽及水牛奶鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种水牛奶特征肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示；利用水牛奶特征肽鉴定水牛奶的方法，包括：在待测物中加入蛋白质沉淀剂，超声、离心，取上清液超滤，得到分子量小于10KDa的超滤液，对超滤液进行脱盐处理，得到脱盐溶液，对脱盐溶液进行液质分析，采集多肽指纹图谱；判断多肽指纹图谱是否含有水牛奶特征肽的离子信号；若多肽指纹图谱含有水牛奶特征肽的离子信号，则测定待测物中水牛奶特征肽的峰面积，记为X；测定与待测物同重量份数的纯水牛奶中水牛奶特征肽的峰面积，记为Y，则待测物中含有的纯水牛奶比例为Y与X的比值。本发明专利技术可检测出待测物中水牛奶的比例，使用方便、快捷。捷。捷。

【技术实现步骤摘要】
水牛奶特征肽及水牛奶鉴定方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
更具体地说，本专利技术涉及一种水牛奶特征肽及水牛奶鉴定方法。

技术介绍

[0002]水牛奶被誉为“奶中之王”，具有很高的营养价值，其中的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质等都是人体必须的营养元素，蛋白质和氨基酸种类含量丰富，符合我国居民的健康饮食需求。研究表明，水牛奶的干物质、乳蛋白、乳脂肪、维生素、矿物质等主要营养成分均高于普通奶，水牛奶的总固形物质分别是牛奶、人奶的1.67倍和1.64 倍，脂肪含量分别是牛奶、人奶的2倍以上。水牛奶蛋白是全价蛋白，主要由酪蛋白、乳清蛋白和少量的脂肪球膜蛋白组成，含有人体所需的必须氨基酸，氨基酸含量比牛奶高 31.6％，是营养丰富、高质量的天然动物蛋白食品。水牛奶蛋白胶团直径大，容易形成弹性胶体状态和蛋白网络结构，在乳品加工上更具优势，特别利于干酪的生产。其他营养物质、微量元素和维生素等含量均高于荷斯坦牛，是最接近于人乳的天然食品，素有“白色血液”之称。
[0003]水牛奶因其营养价值高，逐渐受到消费者青睐。然而，由于水牛奶产量低，奶水牛种群数量少等因素影响，导致其奶源成本偏高，受经济利润驱使，奶源造假事件层出不穷，不法商家利用其他动物奶源冒充水牛奶销售，从而牟取高额利润。这种掺假行为不仅损害消费者的合法权益，还会对牛奶过敏的消费者身体健康造成威胁。
[0004]近年来，乳品虚假宣传被曝出，水牛奶源真实性的问题被社会重点关注。目前，水牛奶源真实性检测缺乏有效的检测方法，仅仅依靠蛋白质含量测定、PCR检测和液相色谱法，但这些方法存在准确度低、检测周期长，操作复杂等缺点，例如，已公开的检测畜类源性成分的多重荧光定量PCR试剂盒和检测方法，主要通过提取样品的DNA，实现对绵羊、山羊、牛、牦牛和水牛等6种畜禽的准确检测。此方法具有较好的特异性，具有快速的特点，但这种方法也存在自身的缺陷，由于检测的目标物是畜禽奶中的游离细胞的DNA，其含量受动物品种、生理状态和健康条件的影响，环境微生物也会造成干扰。两种或两种以上的奶源掺杂时，PCR方法均能检测到，对于奶源的真实来源判断和掺杂比例缺乏更为有效的定量分析。高效液相色谱法能够通过检测水牛奶中的蛋白质成分角度分析奶源来源，但不同物种的奶源蛋白质相似性较高，且大分子蛋白质在样品处理中易降解，加之液相色谱法灵敏度低于液质联用法，对于掺假识别带来较大的阻碍。因此，专利技术一种快速、高效、高灵敏度的定性定量检测方法是有必要的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种水牛奶特征肽及水牛奶鉴定方法，利用水牛奶特征肽可鉴定出待测水牛奶中是否含有纯水牛奶以及含有的纯水牛奶的比例，使用方便、快捷。
[0006]为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种水牛奶特征肽，所述水
牛奶特征肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
[0007]利用所述水牛奶特征肽鉴定水牛奶的方法，包括以下步骤：
[0008]S1、在待测物中加入蛋白质沉淀剂，超声、离心，取上清液超滤，得到分子量小于 10KDa的超滤液，对所述超滤液进行脱盐处理，得到脱盐溶液，对所述脱盐溶液进行液质分析，采集多肽指纹图谱；
[0009]S2、判断S1中的多肽指纹图谱是否含有水牛奶特征肽的离子信号：若含有水牛奶特征肽的离子信号，则说明待测物中含有水牛奶，若不含有水牛奶特征肽的离子信号，则说明待测物中不含有水牛奶。
[0010]优选的是，还包括以下步骤：
[0011]S3、若S1中的多肽指纹图谱含有水牛奶特征肽的离子信号，则测定待测物中水牛奶特征肽的峰面积，记为X；
[0012]S4、测定与待测物同重量份数的纯水牛奶中水牛奶特征肽的峰面积，记为Y，则待测物中含有的纯水牛奶比例为Y与X的比值。
[0013]优选的是，S1中在待测物中加入蛋白质沉淀剂后超声的具体操作为：向待测物中加入酸性沉淀剂，调节pH至4.0后加入硫酸铵，得混合液，室温超声波萃取10min；其中，所述待测物与所述酸性沉淀剂的体积比为1:2，所述硫酸铵的浓度为1mol/L，所述酸性沉淀剂包括重量比为1:8:1的三氯乙酸、三氯甲烷、丙酮。
[0014]优选的是，S1中超滤的具体操作为，将S1中的上清液转移至截留分子量为30KDa 的超滤管内，10000g离心10min，得到一级超滤液；将所述一级超滤液转移至截留分子量为10KDa的超滤管内，10000g离心10min，得到分子量小于10KDa的超滤液。
[0015]优选的是，S1中采用ZipTip C18脱盐柱进行脱盐处理。
[0016]优选的是，S1中液质分析时采用的流动相A为：2％乙腈，0.1％甲酸，97.9％水；流动相B为：98％乙腈，0.1％甲酸，1.9％水；梯度洗脱条件：0～5min，流动相B为 2％～12％；5～30min，流动相B为12％～20％；30～43min，流动相B为20％～32％；48～58min，流动相B为98％，体系流速300nL/min。
[0017]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0018]第一、本专利技术公开了一种水牛奶特征肽及水牛奶鉴定方法，利用水牛奶特征肽可鉴别待测物中是否含有纯水牛奶以及待测物中含有的纯水牛奶的比例，可用于检测水牛奶是否掺假以及掺假比例，使用方便，检测快速。
[0019]第二、本专利技术中采用酸性沉淀剂和盐析沉淀剂相结合去除蛋白质的方法，大大提高了干扰蛋白质的去除效率，以内源多肽作为检测指标，相较常规的酶解方法，去除了繁琐的酶切步骤，结合超声萃取，提高了水牛奶中多肽的提取效率和操作时间，仅需60分钟即可完成样品制备和纯化。
[0020]第三、本专利技术采用高分辨液质联用仪作为检测手段，只需要取样微量的待测水牛奶样品，即可达到有效检测目的，nmol级(10
‑9)内源多肽的即可达到有效检测的目的，检测灵敏度高。
[0021]第四、本专利技术利用超高压纳升液相色谱分离，采用的色谱柱为Acclaim PepMap RSLCC
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分析柱，该分析柱是小颗粒填料的多肽专用毛细管色谱柱，相对于其他方法，其保留时间稳定无误差，多次实验重复，每次重复的保留时间和峰面积均保持一致，不仅可以通
过水牛奶特征肽定性检测待测水牛奶中是否含有纯水牛奶，还可以通过水牛奶特征肽的峰面积精确定量待测水牛奶中纯水牛奶的比例，进而确定掺杂其他奶源的比例，检测重复性好，稳定可靠。
[0022]第五、本专利技术建立了完善的水牛奶内源多肽的分离方法及质谱检测方法，通过质谱技术精确地识别水牛奶中所有的多肽信息，筛选了水牛奶特征多肽作为生物标志物，为水牛奶的质量检测提供了可靠的依据，保障了消费者的健康和权益。
[0023]本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0024]图1为纯水牛奶的质谱图；
[0025]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.水牛奶特征肽，其特征在于，所述水牛奶特征肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。2.利用如权利要求1所述的水牛奶特征肽鉴定水牛奶的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、在待测物中加入蛋白质沉淀剂，超声、离心，取上清液超滤，得到分子量小于10KDa的超滤液，对所述超滤液进行脱盐处理，得到脱盐溶液，对所述脱盐溶液进行液质分析，采集多肽指纹图谱；S2、判断S1中的多肽指纹图谱是否含有水牛奶特征肽的离子信号：若含有水牛奶特征肽的离子信号，则说明待测物中含有水牛奶，若不含有水牛奶特征肽的离子信号，则说明待测物中不含有水牛奶。3.如权利要求2所述的鉴定水牛奶的方法，其特征在于，还包括以下步骤：S3、若S1中的多肽指纹图谱含有水牛奶特征肽的离子信号，则测定待测物中水牛奶特征肽的峰面积，记为X；S4、测定与待测物同重量份数的纯水牛奶中水牛奶特征肽的峰面积，记为Y，则待测物中含有的纯水牛奶比例为Y与X的比值。4.如权利要求2所述的鉴定水牛奶的方法，其特征在于，S1中在待测物中加入蛋白质沉淀剂后超声的具体操作为：向待测物中加入酸性沉淀剂，调节pH至4.0后加入硫酸铵，...

【专利技术属性】
技术研发人员：付强，黄星晨，刘润峰，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：