对CD137和GPC3特异性的新型融合蛋白制造技术

本发明专利技术提供对CD137和GPC3特异性的融合蛋白，其中融合蛋白能够用于以GPC3靶标依赖性方式共刺激淋巴细胞活化。这种融合蛋白可用于许多制药应用中，例如作为用于治疗或预防诸如各种肿瘤的人疾病的抗癌剂和/或免疫调节剂。本发明专利技术还涉及制备本文所述的融合蛋白以及包含这种融合蛋白的组合物的方法。本发明专利技术进一步涉及编码这种融合蛋白的核酸分子和用于产生这种融合蛋白和核酸分子的方法。此外，本申请公开了这些融合蛋白以及包含一种或多种这种融合蛋白的组合物的治疗性和/或诊断性用途。合蛋白的组合物的治疗性和/或诊断性用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对CD137和GPC3特异性的新型融合蛋白
I.
技术介绍

[0001]磷脂酰肌醇聚糖
‑
3(GPC3，也称为DGSX、GTR2
‑
2、MXR7、OCI
‑
5、SDYS、SGB、SGBS和SGBS1)是一种属于糖基
‑
磷脂酰肌醇
‑
锚式硫酸肝素蛋白聚糖的磷脂酰肌醇聚糖家族的癌胚抗原。GPC3在发育过程中在各种组织中表达，通过如成纤维细胞生长因子(FGF)、非经典Wnt或胰岛素样生长因子信号通路在形态发生和生长中发挥重要作用(Cheng等，Carcinogenesis,2008；Song等，J Biol Chem,2005；Song等，J Biol Chem,1997)。然而，在大多数正常成人组织中，GPC3表达下调或沉默。另外，根据细胞类型，GPC3可以正向和负向调节细胞生长。GPC3的功能丧失突变是Simpson
‑
Golabi
‑
Behmel或Simpson畸形综合征(SGBS)的原因，这是一种罕见的X染色体连锁过度生长障碍，SGBS患者具有增加的胚胎肿瘤(包括Wilms
’
肿瘤)的风险(Pilia等，Nat Genet,1996)。
[0002]GPC3在各种类型的癌症包括肝癌、胃癌、黑色素瘤、高级别尿路上皮癌、睾丸癌和一些子宫癌和阴道癌中表达(Aydin等，Diagn Pathol,2015；Ushiku等，Cancer Sci,2009；Gailey和Bellizzi,Am J Clin Pathol,2013；Yamanaka等，Oncology,2007；Nakatsura等，Clin Cancer Res,2004；Zynger等，Am J Surg Pathol,2006；Montalbano等，Int J Oncol,2016；Midorikawa等，Int J Cancer,2003)。特别地，GPC3在肝细胞癌(HCC)中高度表达(Capurro等，Gastroenterology,2003；Nakatsura等，Biochem Biophys Res Commun,2003；Sung等，Cancer Sci,2003；Zhu等，Gut,2001)，肝细胞癌是肝癌的主要形式，其占所有肝癌的90％，并每年导致至少500,000人死亡(Jelic等，Ann Oncol,2010)。已经对GPC3作为HCC和其它癌症类型的诊断生物标志物和治疗靶点进行了广泛研究。已经得到了一些靶向GPC3的抗体，包括人源化小鼠抗体YP7和GC33以及人抗体HN3和MDX
‑
1414，然而这些抗体并未显示出抑制HCC细胞增殖或诱导细胞凋亡的能力(Feng和Ho，FEBS Lett,2014)。特别地，GC33目前正在针对HCC的临床试验中进行评估。GC33功能的机制包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，但是GC33不直接抑制GPC3
‑
阳性肿瘤细胞的增殖(Takai等，Cancer Biol Ther,2009；Nakano等，Biochem Biophys Res Commun,2009；Ishiguro等，Cancer Res,2008)。然而，虽然已证明GC33在体内表现出肿瘤生长抑制，但它并没有提供令人满意的临床疗效。同时，敲低和siRNA实验结果表明GPC3并非HCC细胞的致死基因，这使得无法确定抗
‑
GPC3抗体能否有效地使肿瘤消退。
[0003]分化簇137或CD137(也称为4
‑
1BB或TNFRS9)是一种共刺激性免疫受体及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。其主要在活化的CD4+与CD8+ T细胞、活化的B细胞和天然杀伤(NK)细胞上表达，但也可在静息的单核细胞和树突状细胞(Li和Liu,Clin Pharmacol,2013)或内皮细胞(Snell等，Immunol Rev,2011)上发现。CD137在调节免疫应答中扮演重要作用，因此是癌症免疫疗法的靶标。CD137配体(CD137L)是已知的CD137的唯一天然配体，并在一些诸如活化的B细胞、单核细胞和脾脏树突状细胞的抗原呈递细胞上组成型表达，也可在T淋巴细胞上诱导CD137配体。
[0004]CD137L是一种以膜结合形式和可溶性变体存在的三聚体蛋白。但是，可溶性CD137L活化例如表达CD137的淋巴细胞上的CD137的能力是受限的，需要高浓度才能引发效
应(Wyzgol等，J Immunol,2009)。活化CD137的天然方法为通过CD137
‑
阳性细胞与CD137L阳性细胞的接合。认为然后通过在相对细胞上的CD137L的聚集来诱导CD137的活化，导致经由TRAF1、2、和3的信号传导(Yao等，Nat Rev Drug Discov,2013；Snell等，Immunol Rev,2011)和进一步在CD137
‑
阳性T细胞中伴发下游效应。在通过它们相应的同源靶标的识别来活化T细胞的情况下，由共刺激CD137而引发的效应为进一步增强的活化、增强的存活和增殖、促炎性细胞因子的产生以及改善的杀伤能力。
[0005]已经在许多体内模型中证实了CD137共刺激对消除癌细胞的益处。CD137L在肿瘤上的过(forced)表达导致了例如肿瘤排斥(Melero等，Eur JImmunol,1998)。类似地，抗
‑
CD137 scFv在肿瘤上的过表达导致CD4
+ T细胞和NK
‑
细胞依赖性肿瘤消除(Yang等，Cancer Res,2007；Zhang等，Mol Cancer Ther,2006；Ye等，Nat Med,2002)。还证实了，系统地施用抗
‑
CD137抗体导致肿瘤生长迟缓(Martinet等，Gene Ther,2002)。
[0006]研究还表明，CD137是人肿瘤中天然存在的肿瘤反应性T细胞的极佳标记物(Ye等，Clin Cancer Res,2014)，并且抗
‑
CD137抗体可用于改进CD8
+
黑色素瘤浸润的淋巴细胞的扩增和活性，以用于过继性T细胞疗法(Chacon等，PLoS One,2013)。
[0007]CD137共刺激的潜在治疗益处的临床前论证促进了靶向CD137的治疗性抗体包括BMS
‑
663513(在美国专利No.7,288,638中描述)和PF
‑
05082566(Fisher等，Cancer Immunol Immunother,2012)的开发。
[0008]除其它之外，本专利技术提供了经由一种或多种融合蛋白同时接合CD137和GPC3的新手段，该种融合蛋白具有针对CD137的结合特异性和针对GPC3的结合特异性的性质。
[0009]II.定义
[0010]以下所列定义了在本说明书中使用的术语、短语本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种能够结合CD137和GPC3的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含至少两个任意顺序的亚基，其中第一亚基包含全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域且是对GPC3特异性的，和其中第二亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白且是对CD137特异性的。2.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白包含至少两个亚基，其中第一亚基包含全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域且是对GPC3特异性的，和其中第二亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白且是对CD137特异性的，其中所述第二亚基任选地经由连接子以N
‑
末端连接至所述第一亚基的每条重链的C
‑
末端。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，(a)其中所述融合蛋白能够以至多约1nM的K
D
值结合GPC3或能够以与包含于所述第一亚基中的免疫球蛋白或其抗原结合结构域单独的K
D
值相当或更低的K
D
值结合GPC3；(b)其中所述融合蛋白能够以至多约3nM的EC
50
值结合CD137或能够以与包含于所述第二亚基中的对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白单独的EC
50
值相当或更低的EC
50
值结合CD137；(c)其中所述融合蛋白与猕猴GPC3交叉反应；(d)其中当在ELISA分析中测量所述融合蛋白时，所述融合蛋白能够以至多约10nM的EC
50
值同时结合CD137和GPC3；(e)其中所述融合蛋白能够结合表达GPC3的肿瘤细胞；(f)其中所述融合蛋白能够诱导IL
‑
2的分泌增加；(g)其中与SEQ ID NO:83相比，所述融合蛋白能够诱导IL
‑
2分泌增加至更高水平；和/或与SEQ ID NO:83相比，所述融合蛋白能够以更好的效率诱导IL
‑
2的分泌增加；(h)其中所述融合蛋白能够诱导淋巴细胞介导的细胞毒性；(i)其中与SEQ ID NO:83相比，所述融合蛋白能够诱导由T细胞介导的表达GPC3的肿瘤细胞的杀伤增强；和/或与SEQ ID NO:83相比，所述融合蛋白能够以更好的效率诱导细胞毒性T细胞活化；(j)其中所述融合蛋白能够以GPC3依赖性方式共刺激T细胞应答；或(k)其中所述融合蛋白能够在肿瘤微环境中共刺激T细胞应答。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白在小鼠中具有至少50小时、至少75小时、至少100小时、至少125小时、至少150小时、至少175小时、至少200小时、至少250小时或甚至更长的半衰期，和/或其中所述融合蛋白在小鼠中具有比SEQ ID NO:83的半衰期更长的半衰期。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有至少6.5、至少6.8、至少7.1、至少7.4、至少7.5、至少7.7或甚至更高的等电点，和/或其中所述融合蛋白具有比SEQ ID NO:83的等电点更高的等电点。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置28、36、40
‑
41、49、52、65、68、70、72
‑
73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的位置处包含一个或多个突变的氨基酸残基。7.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的线性多肽序列(SEQ ID NO:2)
的位置20、25、28、33、36、40
‑
41、44、49、52、59、68、70
‑
73、77
‑
82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132和134的位置处包含一个或多个突变的氨基酸残基。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的融合蛋白，其中与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:2)相比，所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基的组之一：(a)Gln 28
→
His；Leu 36
→
Gln；Ala 40
→
Ile；Ile 41
→
Lys；Gln 49
→
Asn；Tyr 52
→
Met；Ser 68
→
Gly；Leu 70
→
Thr；Arg 72
→
Asp；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Thr；Trp 79
→
Ala；Arg 81
→
Ser；Cys 87
→
Ser；Asn 96
→
Lys；Tyr 100
→
Phe；Leu 103
→
His；Tyr 106
→
Ser；Lys 125
→
Phe；Ser 127
→
Phe；Tyr 132
→
Glu；和Lys 134
→
Tyr；(b)Gln 28
→
His；Leu 36
→
Gln；Ala 40
→
Ile；Ile 41
→
Arg；Gln 49
→
Ile；Tyr 52
→
Met；Asn 65
→
Asp；Ser 68
→
Met；Leu 70
→
Lys；Arg 72
→
Asp；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Met；Trp 79
→
Asp；Arg 81
→
Trp；Cys 87
→
Ser；Asn 96
→
Lys；Tyr 100
→
Phe；Leu 103
→
His；Tyr 106
→
Ser；Lys 125
→
Phe；Ser 127
→
Phe；Tyr 132
→
Glu；和Lys 134
→
Tyr；(c)Gln 28
→
His；Leu 36
→
Gln；Ala 40
→
Ile；Ile 41
→
Arg；Gln 49
→
Asn；Tyr 52
→
Met；Asn 65
→
Asp；Ser 68
→
Ala；Leu 70
→
Ala；Arg 72
→
Asp；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Thr；Trp 79
→
Asp；Arg 81
→
Trp；Cys 87
→
Ser；Asn 96
→
Lys；Tyr 100
→
Phe；Leu 103
→
His；Tyr 106
→
Ser；Lys 125
→
Phe；Ser 127
→
Phe；Tyr 132
→
Glu；和Lys 134
→
Tyr；(d)Gln 28
→
His；Leu 36
→
Gln；Ala 40
→
Ile；Ile 41
→
Lys；Gln 49
→
Asn；Tyr 52
→
Met；Asn 65
→
Asp；Ser 68
→
Ala；Leu 70
→
Ala；Arg 72
→
Asp；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Thr；Trp 79
→
Asp；Arg 81
→
Trp；Cys 87
→
Ser；Asn 96
→
Lys；Tyr 100
→
Phe；Leu 103
→
His；Tyr 106
→
Ser；Lys 125
→
Phe；Ser 127
→
Phe；Tyr 132
→
Glu；和Lys 134
→
Tyr；(e)Gln 28
→
His；Leu 36
→
Gln；Ala 40
→
Ile；Ile 41
→
Lys；Gln 49
→
Ser；Tyr 52
→
Met；Asn 65
→
Asp；Ser 68
→
Gly；Leu 70
→
Ser；Arg 72
→
Asp；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Thr；Trp 79
→
Ala；Arg 81
→
Met；Cys 87
→
Ser；Asn 96
→
Lys；Tyr 100
→
Phe；Leu 103
→
His；Tyr 106
→
Ser；Lys 125
→
Phe；Ser 127
→
Phe；Tyr 132
→
Glu；和Lys 134
→
Tyr；(f)Gln 28
→
His；Leu 36
→
Gln；Ala 40
→
Ile；Ile 41
→
Lys；Gln 49
→
Val；Tyr 52
→
Met；Asn 65
→
Asp；Ser 68
→
Gly；Leu 70
→
Thr；Arg 72
→
Asp；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Arg；Trp 79
→
Asp；Arg 81
→
Ser；Cys 87
→
Ser；Leu 94
→
Phe；Asn 96
→
Lys；Tyr 100
→
Phe；Leu 103
→
His；Tyr 106
→
Ser；Lys 125
→
Phe；Ser 127
→
Phe；Tyr 132
→
Glu；和Lys 134
→
Tyr；(g)Gln 28
→
His；Leu 36
→
Gln；Ala 40
→
Ile；Ile 41
→
Arg；Gln 49
→
His；Tyr 52
→
Met；Asn 65
→
Asp；Ser 68
→
Gly；Leu 70
→
Thr；Arg 72
→
Asp；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Thr；Trp 79
→
Ala；Arg 81
→
Ser；Cys 87
→
Ser；Asn 96
→
Lys；Tyr 100
→
Phe；Leu 103
→
His；Tyr 106
→
Ser；Lys 125
→
Phe；Ser 127
→
Phe；Tyr 132
→
Glu；和Lys 134
→
Tyr；(h)Gln 28
→
His；Leu 36
→
Gln；Ala 40
→
Ile；Ile 41
→
Lys；Gln 49
→
Asn；Tyr 52
→
Met；Asn 65
→
Asp；Ser 68
→
Gly；Leu 70
→
Thr；Arg 72
→
Asp；Lys73
→
Asp；Asp 77
→
Thr；Trp 79
→
Ala；Arg 81
→
Ser；Phe 83
→
Leu；Cys 87
→
Ser；Leu 94
→
Phe；Asn 96
→
Lys；Tyr 100
→
Phe；Leu 103
→
His；Tyr 106
→
Ser；Lys 125
→
Phe；Ser 127
→
Phe；Tyr 132
→
Glu；和Lys 134
→
Tyr；(i)Gln 28
→
His；Leu 36
→
Gln；Ala 40
→
Ile；Ile 41
→
Arg；Gln 49
→
Ser；Tyr 52
→
Met；Asn 65
→
Asp；Ser 68
→
Ala；Leu 70
→
Thr；Arg 72
→
Asp；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Asn；Trp 79
→
Ala；Arg 81
→
Ser；Cys 87
→
Ser；Asn 96
→
Lys；Tyr 100
→
Phe；Leu 103
→
His；Tyr 106
→
Ser；Lys 125
→
Phe；Ser 127
→
Phe；Tyr 132
→
Glu；和Lys 134
→
Tyr；(j)Leu 36
→
Met；Ala 40
→
Asn；Ile 41
→
Leu；Gln 49
→
His；Tyr 52
→
Ser；Ser 68
→
Asp；Leu 70
→
Met；Arg 72
→
Leu；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Gln；Trp 79
→
Ile；Arg 81
→
Trp；Asn 96
→
Phe；Tyr 100
→
Asp；Leu 103
→
His；Lys 125
→
Ser；Ser 127
→
Ile；Tyr 132
→
Trp；和Lys 134
→
Gly；(k)Leu 36
→
Met；Ala 40
→
Asn；Ile 41
→
Leu；Gln 49
→
His；Tyr 52
→
Ser；Ser 68
→
Asp；Leu 70
→
Met；Arg 72
→
Leu；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Gln；Trp 79
→
Ile；Arg 81
→
Trp；Phe 92
→
Leu；Asn 96
→
Phe；Lys 98
→
Arg；Tyr 100
→
Asp；Pro 101
→
Leu；Leu 103
→
His；Lys 125
→
Ser；Ser 127
→
Ile；Tyr 132
→
Trp；和Lys 134
→
Gly；(l)Asn 25
→
Tyr；Leu 36
→
Met；Ala 40
→
Asn；Ile 41
→
Leu；Gln 49
→
His；Tyr 52
→
Gly；Ser 68
→
Asp；Leu 70
→
Met；Phe 71
→
Leu；Arg 72
→
Leu；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Gln；Trp 79
→
Ile；Arg 81
→
Gln；Phe 92
→
Ser；Asn 96
→
Phe；Tyr 100
→
Asp；Leu 103
→
His；Lys 125
→
Ser；Ser 127
→
Ile；Tyr 132
→
Trp；和Lys 134
→
Gly；(m)Leu 36
→
Met；Ala 40
→
Asn；Ile 41
→
Leu；Gln 49
→
His；Tyr 52
→
Gly；Ser 68
→
Asp；Leu 70
→
Met；Arg 72
→
Leu；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Gln；Tyr 78
→
His；Trp 79
→
Ile；Arg 81
→
Trp；Phe 92
→
Leu；Asn 96
→
Phe；Tyr 100
→
Asp；Leu 103
→
His；Lys 125
→
Ser；Ser 127
→
Ile；Tyr 132
→
Trp；和Lys 134
→
Gly；(n)Asn 25
→
Asp；Leu 36
→
Met；Ala 40
→
Asn；Ile 41
→
Leu；Gln 49
→
His；Tyr 52
→
Gly；Ser 68
→
Asp；Leu 70
→
Met；Arg 72
→
Leu；Lys 73
→
Asp；Asp 77
→
Gln；Trp 79
→
Ile；Arg 81
→
Trp；Phe 92
→
Leu；Asn 96
→
Phe；Tyr 100
→
Asp；Leu 103
→
His；Lys 125
→
Ser；Ser 127
→
Ile；Tyr 132
→
Trp；...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：皮里斯制药有限公司，
类型：发明
国别省市：