淀粉样前体蛋白作为胆道闭锁的诊断标志物制造技术

提供了利用淀粉样前体蛋白对胆道闭锁进行诊断和预后的新方法。行诊断和预后的新方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】淀粉样前体蛋白作为胆道闭锁的诊断标志物
[0001]专利技术背景
[0002]胆道闭锁是发生在婴儿中的肝脏和胆管疾病。通常，胆道闭锁的症状在出生后约2周至8周出现或发展。肝脏内的细胞产生胆汁，胆汁是帮助消化脂肪的消化液。它还将废物从肝脏运送到肠道排泄。这种产生胆汁、胆汁消化脂肪并最终移动至肠道的通道和管道网络被称为胆管系统。在正常生理条件下，胆管系统允许胆汁从肝脏排入肠道。然而，当婴儿患有胆道闭锁时，阻塞了胆汁从肝脏流到胆囊。这会导致胆汁被困在肝脏内，这会迅速造成肝脏细胞损伤和瘢痕，导致肝硬化并最终导致肝功能衰竭。
[0003]虽然胆道闭锁的确切原因尚未完全阐明，但据信一些婴儿由于其胆管在妊娠期未恰当形成而发展为胆道闭锁。对于大多数其他患有胆道闭锁的儿童，他们的胆管可能响应于出生后获得的病毒感染而受到身体免疫系统的损害。尽管胆道闭锁是罕见疾病，但它影响亚洲人群的比率明显高于其他种族。胆道闭锁的诊断依赖于血液检查、腹部超声、肝脏活检以及诊断性手术(可包括手术胆管造影照片)。一旦确诊，胆道闭锁将通过Kasai程序或肝门肠吻合术进行治疗。这种手术通常能达到65
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85％的成功率，但在一小部分婴儿中仍会导致失败，他们可能随后需要进行肝脏移植才能长期存活。由于胆道闭锁可能危及生命，因此迫切需要新的且更可靠的方法来早期诊断疑似患有胆道闭锁的婴儿以及在已进行Kasai程序的婴儿中进行风险评估。本专利技术满足了该需求和其他相关需求。
[0004]专利技术概述
[0005]本专利技术人观察到处于发展胆道闭锁的风险或患有胆道闭锁并且通过Kasai程序治疗胆道闭锁效果不佳的婴儿的肝脏组织中淀粉样前体蛋白的表达增加。因此，该发现允许设计新方法用于胆道闭锁的诊断或预后。
[0006]第一方面，本专利技术提供了通过检测取自婴儿的肝脏样品中淀粉样前体蛋白(APP)的水平而在婴儿中诊断胆道闭锁(BA)或评估胆道闭锁(BA)风险的方法。该方法包括这些步骤：(i)确定取自婴儿的肝脏样品中APP的表达水平；(ii)检测到APP表达水平与标准对照水平相比增加；和(iii)确定婴儿患有BA或发展胆道闭锁的风险增加。
[0007]在一些实施方案中，APP表达水平是APP mRNA水平或蛋白水平。在一些实施方案中，步骤(i)包括逆转录聚合酶链式反应(RT
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PCR)或免疫测定。在一些实施方案中，肝脏样品是肝脏活检。在一些实施方案中，该方法在步骤(iii)之后进一步包括对BA进行至少一种额外的诊断测试以确认诊断的步骤。在一些实施方案中，该方法可在步骤(iii)之后进一步包括用Kasai程序治疗婴儿的步骤。
[0008]第二方面，本专利技术提供了用于在婴儿被诊断患有BA并接受Kasai程序后评估婴儿中不良结果(如，无效Kasai程序)的可能性的方法。该方法包括这些步骤：(i)确定取自婴儿的肝脏样品中APP的表达水平；(ii)检测到APP表达水平与标准对照水平相比增加；和(iii)确定Kasai程序可能失败。
[0009]在一些实施方案中，APP表达水平是APP mRNA水平或蛋白水平。在一些实施方案中，步骤(i)包括逆转录聚合酶链式反应(RT
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PCR)或免疫测定。在一些实施方案中，肝脏样品是肝脏活检。在一些实施方案中，该方法在步骤(iii)之后进一步包括对BA进行至少一种
额外的诊断测试以确认预后的步骤—如果对BA的额外测试表明存在BA，则可得出治疗可能失败的结论。在一些实施方案中，该方法可在步骤(iii)之后进一步包括为婴儿提供进一步治疗如肝脏移植的步骤。
[0010]第三方面，本专利技术提供了用于在婴儿中诊断BA、评估发展BA的风险或对不成功的Kasai程序进行预后的试剂盒。该试剂盒包括含有至少一种用于检测APP的mRNA或蛋白水平的试剂的第一容器，和含有健康肝脏组织中的具有平均APP表达水平的标准对照样品的第二容器。
[0011]在一些实施方案中，APP表达水平是APP mRNA水平或APP蛋白水平。在一些实施方案中，第一容器含有一种或多种用于RT
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PCR的试剂。在一些实施方案中，第一容器含有一种或多种用于免疫测定的试剂。在一些实施方案中，第一容器中含有的一种或多种试剂包括一组用于PCR的引物。在一些实施方案中，第一容器中含有的一种或多种试剂包括抗APP的抗体。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包括使用该试剂盒的用户说明书。
[0012]附图简述
[0013]图1.对照和BA肝脏的主成分分析。
[0014]图2.BA胆管中APP的表达。对胆道闭锁(A)和正常对照(B；肝母细胞瘤)的肝脏切片进行APP(红色)和CK19(绿色；胆管标志物)的免疫荧光染色。显示六名BA患者(BA1至BA6)和两名HB患者(HB1和HB2)的肝脏切片照片以进行比较。突出显示的区域被放大并在右侧示出。
[0015]定义
[0016]如本文所用，“淀粉样前体蛋白(APP)”是指由位于(人)21号染色体的基因编码的膜蛋白。在许多物种中发现的高度保守的蛋白，人APP由于可变剪接有几种已知的同种型，长度范围为639至770个氨基酸，其中某些同种型优先在神经元中表达。作为在许多组织中表达并集中在神经元突触中的完整膜蛋白，APP被认为是突触形成、神经可塑性和铁输出的调节剂，尽管其确切功能尚未得到完全理解。术语“淀粉样前体蛋白”或“APP”在本文中用于广泛地涵盖该蛋白的任何同种型，例如天然存在的同源物或直系同源物或突变体，包括源自全长APP的蛋白或肽，例如通过其蛋白水解产生的肽，如β淀粉样蛋白(Aβ)，这是含有约37至约49个氨基酸残基的多肽，其淀粉样蛋白纤维形式是阿尔茨海默病患者大脑中发现的淀粉样斑块的主要成分。优选地，APP被特异性识别全长APP的抗体特异性识别，如由表3中列出的任一多核苷酸序列编码的多肽。
[0017]胆道闭锁(BA)是肝脏和胆管中的胆管道系统阻塞的疾病，通常发生在2周至2个月年龄范围的婴儿中。胆道闭锁的症状包括黄疸、深色尿液、无胆汁大便(粘土色大便)、体重减轻和易怒。BA的首选治疗方法是Kasai程序或操作，这是可让胆汁从肝脏中排出从而避免对肝脏造成永久性损伤的外科旁路程序。如本文所用，患有BA的受试者是已被诊断患有BA但尚未接受Kasai程序的婴儿(如，年龄约1周或约2周或约3周至约1个月或约2个月或约3个月)，或已被诊断患有BA并接受Kasai手术，但尽管接受了Kasai手术仍有与疾病相关的症状的婴儿。
[0018]在本公开中，术语“生物样品”或“样品”包括组织切片，例如活检和尸检样品，以及为组织学目的的冷冻切片，或任何此类样品的加工形式。生物样品包括血液和血液组分或产品(如，血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰或唾液、淋巴和舌头组织、口腔拭子、培养细胞
是指一对引物，其与靶DNA分子的相反链或靶DNA的位于待扩增核苷酸序列(如，为了检测目的编码APP的核苷酸序列，诸如为了评估BA风险或疾病前景，尤其是在Kasai程序后)侧翼的区域杂交。在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于婴儿中诊断胆道闭锁(BA)或评估发展BA的风险的方法，其包括：(i)确定取自婴儿的肝脏样品中淀粉样前体蛋白(APP)的表达水平；(ii)与标准对照值相比，检测到步骤(i)中APP表达水平的增加；和(iii)确定婴儿患有BA或具有增加的发展BA的风险。2.权利要求1所述的方法，其中所述APP表达水平是APP mRNA水平。3.权利要求1所述的方法，其中所述APP表达水平是APP蛋白水平。4.权利要求2所述的方法，其中步骤(i)包括逆转录聚合酶链式反应(RT
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PCR)。5.权利要求3所述的方法，其中步骤(i)包括免疫测定。6.权利要求1所述的方法，其中所述肝脏样品是肝脏活检。7.权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(iii)之后进行至少一种附加的BA诊断测试的步骤。8.权利要求7所述的方法，其还包括在步骤(iii)之后用Kasai程序治疗婴儿的步骤。9.用于评估患有BA且已进行Kasai程序的婴儿中无效Kasai程序可能性的方法，其包括：(i)确定取自婴儿的肝脏样品中淀粉样前体蛋白(APP)的表达水平；(ii)与标准对照值相比，检测到步骤(i)中APP表达水平的增加；和(iii)确定Kasai程序可能无效。10.权利要求9所述的方法，其中所述APP表达水平是APP ...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕志恒，R奥塔坎达蒂尔巴布，PKH谭，
申请(专利权)人：港大科桥有限公司，
类型：发明
国别省市：