生产氨基酸的谷氨酸棒杆菌以及利用该谷氨酸棒杆菌生产氨基酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产L

【技术实现步骤摘要】
生产氨基酸的谷氨酸棒杆菌以及利用该谷氨酸棒杆菌生产氨基酸的方法


[0001]本专利技术涉及生物技术和基因工程领域。具体地说，本专利技术涉及生产氨基酸的谷氨酸棒杆菌以及利用该谷氨酸棒杆菌生产氨基酸的方法，更具体涉及L
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赖氨酸高产谷氨酸棒杆菌菌株、所述高产菌株的构建方法和应用。

技术介绍

[0002]L
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赖氨酸，简称赖氨酸，是人类和动物营养中最重要的必需氨基酸，被广泛应用于医药、食品、动物饲料和化妆品等行业中。目前，赖氨酸的主要生产为微生物发酵法，谷氨酸棒杆菌是目前工业中最重要的生产菌株。
[0003]随着生物技术的不断发展，近年来，对谷氨酸棒杆菌进行遗传改造以提高其赖氨酸产量的方法也不断出现，包括赖氨酸合成途径的改造，加强四碳回补途径，加强赖氨酸外排等等，如CN1206342C报道通过增强dapA基因、lysC基因、dapB基因、pyc基因和lysE基因的表达，从而使菌株中的赖氨酸产量增加。当前赖氨酸工业生产菌株的产酸能力已达到较高的水平，但菌株的产量尚未达到理论最大转化率。
[0004]如何进一步提高菌株的产酸水平，提高转化率，降低赖氨酸的生产成本，是本领域人员需要解决的问题。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，专利技术人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现一种编码假定蛋白的基因cgl2639基因，使得该基因失活能够显著提高赖氨酸的产量，从而获得赖氨酸的高产菌株。在此基础上完成了本专利技术。所述基因编码具有SEQ ID NO:1所示多肽所示的序列。其来源于谷氨酸棒杆菌，注释为假定蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。通过BLAST分析发现，该蛋白多肽在不同谷氨酸棒杆菌中保守性极高，氨基酸序列的一致性达到90%以上。因此，虽然谷氨酸棒杆菌中该蛋白多肽的功能未知，但可以预测其在不同谷氨酸棒杆菌中具有相同的功能。在本专利技术人通过全基因组敲除库的构建发现SEQ ID NO:1所示多肽的失活可以提高谷氨酸棒杆菌L
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赖氨酸产量后，本领域技术可以从中得到启示，即失活其他谷氨酸棒杆菌内源性的与SEQ ID NO:1所示多肽同源性90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%以上的多肽，也可以提高L
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赖氨酸产量，因此，采用同样手段失活与SEQ ID NO:1所示多肽同源性90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%以上的多肽生产赖氨酸的方法，也应该包括在本专利技术的保护范围内。
[0006]由此，本专利技术提供一种生产L
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赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株能产赖氨酸，且具有如下（i）
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（ii）至少一项所示的特性：（i）内源的如SEQ ID NO: 1所示的多肽或其同源多肽的活性降低或消失；（ii）内源的如SEQ ID NO: 2所示的多核苷酸或者同源多核苷酸的表达水平降低或消失。
[0007]其中，只要谷氨酸棒杆菌出发菌具有产L
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赖氨酸的能力，通过遗传改造而具备上述特性，则能提高菌株产L
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赖氨酸的能力。如果出发菌本身不能产生L
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赖氨酸，则可以改造获得产L
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赖氨酸的能力，进而结合上述遗传改造，同样也能提高菌株产L
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赖氨酸的能力。
[0008]在具体的实施方式中，所述多肽活性降低或消失是指，与野生型内源性多肽相比，所述多肽的编码基因的转录、表达降低至少30%，或所述多肽的编码基因被消除；或者所述多肽的活性降低至少30%。
[0009]在具体实施方式中，所述内源性多肽的失活可以通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除编码基因；对其编码的基因进行突变；改变编码基因的启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或编码的蛋白的结构不稳定；或通过修饰细胞中基因编码区使其转录或表达弱化或其编码蛋白活性降低或丧失；或者通过修饰细胞中所述基因编码区的上下游区域使其转录或表达弱化或丧失，或者通过物理或化学方法诱变后筛选得到。
[0010]更优选地，所述菌株进一步还包括选自以下的一个或几个基因过表达或表达产物活性增强：a1. 编码解除赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶lysC基因；b1. 编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；c1. 编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；d1. 编码二氨基庚二酸脱水酶的ddh基因；e1. 编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；f1. 编码天冬氨酸
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半醛脱水酶的asd基因；g1. 编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；h1. 编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因；i1. 编码赖氨酸的运输蛋白lysE基因。
[0011]还优选地，进一步还包括选自以下的一个或几个基因表达降低或表达产物活化降低：a2. 编码乙醇脱水酶的adhE基因；b2. 编码乙酸激酶的ackA基因；c2. 编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；d2. 编码乳酸脱水酶的ldhA基因；e2. 编码甲酸转运蛋白的focA基因；f2. 编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；g2. 编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；h2. 编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱水酶I双功能酶的thrA基因；i2. 编码高丝氨酸激酶的thrB基因；j2. 编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；k2. 编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。
[0012]在进一步优选的实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌的出发菌株是谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067及其衍生
菌株。
[0013]在一个具体的实施方式中，本专利技术通过对谷氨酸棒杆菌AHP（该菌株是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基础上，将天冬氨酸激酶LysC的311位苏氨酸被异亮氨酸取代，同时，将丙酮酸激酶Pyc的458位脯氨酸由丝氨酸取代）中的cgl2639基因进行敲除，获得了工程菌株AHP（ΔCgl2639），该菌株的赖氨酸产量较出发菌株有所提高。
[0014]在进一步的实施方式中，cgl2639基因的敲除是通过将同源臂扩增后连接到pK18mobsacB上，获得pK18
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ΔCgl2639质粒，将该质粒转化谷氨酸棒杆菌AHP，经过二次重组后，获得工程菌株AHP（ΔCgl2639）。
[0015]其次，本专利技术提供了一种生产L
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赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，所述菌株经修饰以使所述菌株中具有如下（i）
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（ii）至少一项所示的特性：（i）降低或消除如SEQ ID NO：1所示内源性多肽或其同源多肽的多肽活性；（ii）降低或消除如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸或其同源多核苷酸的表达水平。
[0016]其中，所述多肽降低本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产L
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赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株能产赖氨酸，且具有如下i
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ii至少一项所示的特性：i.内源的如SEQ ID NO: 1所示的多肽或其同源多肽的活性降低或消失；ii.内源的如SEQ ID NO: 2所示的多核苷酸或者同源多核苷酸的表达水平降低或消失。2.如权利要求1所述的生产L
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赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述多肽活性降低或消失是指，与野生型多肽相比，所述多肽的编码基因的转录、表达降低至少30%，或所述多肽的编码基因被消除；或者所述多肽的活性降低至少30%。3.如权利要求1所述的生产L
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赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述内源性多肽的活性降低或消失通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除编码基因；对其编码的基因进行突变；改变编码基因的启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或编码的蛋白的结构不稳定；或通过修饰细胞中基因编码区使其转录或表达弱化或其编码蛋白活性降低或丧失；或者通过修饰细胞中所述基因编码区的上下游区域使其转录或表达弱化或丧失；或者通过物理或化学方法诱变后筛选得到。4.如权利要求1所述的生产L
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赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，进一步还包括选自以下的一个或几个基因过表达或表达产物活性增强：a1. 编码解除赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶lysC基因；b1. 编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；c1. 编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；d1. 编码二氨基庚二酸脱水酶的ddh基因；e1. 编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；f1. 编码天冬氨酸
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半醛脱水酶的asd基因；g1. 编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；h1. 编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因；i1. 编码赖氨酸的运输蛋白lysE基因。5.如权利要求4所述的生产L
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赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，进一步还包括选自以下的一个或几个基因表达降低或表达产物活化降低：a2. ...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑平，张伟，周文娟，孙际宾，刘娇，郭轩，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：