用于表征双链靶多核苷酸的类发夹衔接子、构建体和方法技术

本发明专利技术提供一种用于表征双链靶多核苷酸的类发夹衔接子、构建体和方法。所述类发夹衔接子包含用于分别与所述双链靶多核苷酸的模板链和互补链连接的第一单链和第二单链，所述第一单链与所述第二单链形成至少1个双链核酸区用于在所述模板链通过跨膜孔后使所述互补链靠近所述跨膜孔。还提供包含上述类发夹衔接子的构建体，以及表征双链靶多核苷酸的方法、试剂盒等。本发明专利技术的表征方法具有很多优势，比如平衡靶多核苷酸的模板链和互补链的易位速度、提高测序准确率等。提高测序准确率等。提高测序准确率等。

【技术实现步骤摘要】
用于表征双链靶多核苷酸的类发夹衔接子、构建体和方法


[0001]本申请属于生物分析检测的
，具体涉及使用跨膜孔对双链靶核苷酸进行表征如测序的类发夹衔接子、构建体和方法。

技术介绍

[0002]目前，核酸测序技术在多个场景都有应用需求。现有的测序技术需要在前期对待测序样品进行复杂的处理，并且测序周期长，无法满足临床等应用场景中对核酸测序技术快速、便捷的需要。
[0003]跨膜孔（比如纳米孔）作为生物传感器发展新的核酸测序技术具有巨大的潜力。对纳米孔两侧施加电压后，当分析物（例如核苷酸，多肽）通过纳米孔时造成电流下降，不同结构的分析物所引起的电流阻断程度不同。核苷酸纳米孔可检测分析物通过时所造成的具有已知特征和持续时间的电流阻断。
[0004]在纳米孔测序方法中，使单个多核苷酸通过孔，并直接鉴定所述核苷酸。链测序方法中包括一个核苷酸结合蛋白（比如解旋酶，聚合酶），以作为多核苷酸通过纳米孔的分子制动器。由于纳米孔的尺寸限制可能只有ssDNA可以通过孔，dsDNA在通过孔前需要解链以产生ssDNA。核苷酸结合蛋白（比如解旋酶，聚合酶）能够使dsDNA解链，并通过易位控制多核苷酸的过孔速度。但是无论是聚合酶、解旋酶，还是外切酶，这种方法都不能对互补链进行测序。因此，dsDNA中只有一半的DNA信息被测序。
[0005]因此，对dsDNA的模板链和互补链同时进行测序的方法受到了广泛关注。例如，专利CN 103827320 A公开了一种对dsDNA的模板链和互补链进行测序的方法，该方法利用专门设计的dsDNA构建体的发夹转角。用一种发夹环桥式结构连接dsDNA的两条链，使得在模板链过孔之后互补链能够连续过孔。但是，该方法增加了样品前处理的难度，增加了操作时间，并可能会造成珍贵样品的损失。甚至，由发夹转角连接的模板链和互补链容易在过孔后重新发生杂交，这会增加互补链过孔时的易位速度，使测序的准确率降低。
[0006]另外，专利CN110168104A公开了另一种对dsDNA的模板链和互补链进行测序的方法，该方法通过构造纳米孔复合物实现测序。在纳米孔上通过化学修饰连接上能够与互补链的末端部分序列互补配对的核苷酸探针，当模板链与互补链解旋后过孔时，探针即可捕获互补链使互补链停留在纳米孔的附近，因此，互补链在模板链完全过孔后会存在一定的概率随即过孔。但是，该方法需要对纳米孔进行化学修饰，增加了制备工艺的复杂度；构建文库时，需要分别连接两组衔接子，分别做两次纯化，增加了文库制备的复杂度，降低了文库制备的效率。
[0007]虽然现有技术中公开了对dsDNA的模板链和互补链同时进行测序的方法，但是每种方法各有其缺陷，因此仍然需要开发更优的方法实现对dsDNA的模板链和互补链同时进行实时连续测序，以平衡双链靶多核苷酸的两条链的易位速度并提高测序的准确率。

技术实现思路

[0008]本专利技术人发现通过类发夹衔接子连接的双链靶多核苷酸的两条链而对两条链进行测序具有很多优势，比如平衡靶多核苷酸的模板链和互补链的易位速度、提高测序准确率等。
[0009]因此，本专利技术的第一方面涉及一种用于表征双链靶多核苷酸的类发夹衔接子，所述表征双链靶多核苷酸包括对所述双链靶多核苷酸进行碱基序列测定或序列修饰等信息识别。所述类发夹衔接子包含用于分别与所述双链靶多核苷酸的模板链和互补链连接的第一单链和第二单链，所述第一单链与所述第二单链形成至少1个双链核酸区用于在所述模板链开始通过跨膜孔至完全通过跨膜孔后使所述互补链靠近所述跨膜孔。
[0010]优选地，所述至少1个双链核酸区包括位于所述第一单链和所述第二单链的远离所述双链靶多核苷酸端的第一双链核酸区，所述第一双链核酸区中至少一条链与该条链所在的所述第一单链或所述第二单链的连接处互为反向连接。
[0011]优选地，所述第二单链包含反向连接的第一区段和第二区段，所述第一区段远离所述双链靶多核苷酸的互补链，所述第二区段靠近所述双链靶多核苷酸的互补链，所述第一双链核酸区位于所述第一区段。
[0012]更优选地，所述第二单链为3
’‑5’‑5’‑3’
第二单链或5
’‑3’‑3’‑5’
第二单链；所述3
’‑5’‑5’‑3’
第二单链包含3
’‑5’
第一区段和5
’‑3’
第二区段，所述3
’‑5’
第一区段的5
’
端与所述5
’‑3’
第二区段的5
’
端连接。
[0013]所述5
’‑3’‑3’‑5’
第二单链包含5
’‑3’
第一区段和3
’‑5’
第二区段，所述5
’‑3’
第一区段的3
’
端与所述3
’‑5’
第二区段的3
’
端连接。
[0014]优选地，所述第一单链和所述第二单链均为由碱基基团和无碱基基团形成的单链。
[0015]优选地，所述双链核酸区为非共价连接的双链区。
[0016]优选地，所述第一单链与所述第二单链形成第二双链核酸区，所述第二双链核酸区形成于所述第二单链的所述第二区段。
[0017]优选地，所述第一单链和所述第二单链还形成非互补区。
[0018]更优选地，所述第二单链的第二区段位于所述非互补区的区域包含多核苷酸结合蛋白的结合位点，更优选地，所述第二单链的第一区段位于所述非互补区的区域位于所述第一区段上远离第二区段的位置。
[0019]进一步更优选地，所述第一单链和所述第二单链所形成的所述2个双链核酸区与所述非互补区构成类发夹结构。
[0020]优选地，所述第二单链是通过使用点击化学反应将所述第一区段和所述第二区段反向连接形成的；或者，所述第二单链是通过使用正向碱基和反向碱基直接合成的；优选地，所述点击化学反应所用试剂选自DBCO、Azide、Tetrazine或TCO等化学基团，所述反向碱基选自反向胸苷（反向dTs）、反向腺苷（反向dAs）、反向鸟苷（反向dGs）或反向胞苷（反向dCs）。
[0021]优选地，所述类发夹衔接子包括多核苷酸、多肽或其他具有分子间或分子内相互作用的分子。
[0022]本专利技术的第二方面涉及一种用于表征双链靶多核苷酸的构建体，所述构建体包含
所述双链靶多核苷酸和如上所述类发夹衔接子，所述靶多核苷酸在其一端或其附近与所述类发夹衔接子连接。
[0023]优选地，所述构建体还包含在所述双链靶多核苷酸上与所述类发夹衔接子的相对端连接的至少一种聚合物。
[0024]优选地，所述至少一种聚合物包含在所述双链靶多核苷酸的模板链上连接的前导聚合物，和在所述双链靶多核苷酸的互补链上连接的尾部聚合物，并且所述前导聚合物和所述尾部聚合物形成部分互补双链；更优选地，所述前导聚合物包含多核苷酸结合蛋白的结合位点，所述前导聚合物为由碱基基团和无碱基基团形成的单链，所述尾部聚合物为经过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于表征双链靶多核苷酸的类发夹衔接子，所述类发夹衔接子包含用于分别与所述双链靶多核苷酸的模板链和互补链连接的第一单链和第二单链，所述第一单链与所述第二单链形成至少1个双链核酸区用于在所述模板链开始通过跨膜孔至完全通过跨膜孔后使所述互补链靠近所述跨膜孔。2.根据权利要求1所述的类发夹衔接子，其特征在于，所述至少1个双链核酸区包括位于所述第一单链和所述第二单链的远离所述双链靶多核苷酸端的第一双链核酸区，所述第一双链核酸区中至少一条链与该条链所在的所述第一单链或所述第二单链的连接处互为反向连接；所述第二单链包含反向连接的第一区段和第二区段，所述第一区段远离所述双链靶多核苷酸的互补链，所述第二区段靠近所述双链靶多核苷酸的互补链，所述第一双链核酸区位于所述第一区段。3.根据权利要求1或2所述的类发夹衔接子，其特征在于，所述第一单链与所述第二单链形成第二双链核酸区，所述第二双链核酸区形成于所述第二单链的所述第二区段；所述第一单链和所述第二单链还形成非互补区；所述第二单链的第二区段位于所述非互补区的区域包含多核苷酸结合蛋白的结合位点，所述第二单链的第一区段位于所述非互补区的区域位于所述第一区段上远离所述第二区段的位置。4.根据权利要求1或2所述的类发夹衔接子，其特征在于，所述第二单链是通过使用点击化学反应将所述第一区段和所述第二区段反向连接形成的；或者，所述第二单链是通过使用正向碱基和反向碱基直接合成的。5.一种用于表征双链靶多核苷酸的构建体，其特征在于，所述构建体包含所述双链靶多核苷酸和权利要求1
‑
4中任一项所述的类发夹衔接子，所述双链靶多核苷酸在其一端或其附近与所述类发夹衔接子连接。6.根据权利要求5所述的用于表征双链靶多核苷酸的构建体，其特征在于，所述构建体还包含在所述双链靶多核苷酸上与所述类发夹衔接子的相对端连接的至少一种聚合物；所述至少一种聚合物包含在所述双链靶多核苷酸的模板链上连接的前导聚合物，和在所述双链靶多核苷酸的互补链上连接的尾部聚合物，并且所述前导聚合物和所述尾部聚合物形成部分互补双链；所述前导聚合物包含多核苷酸结合蛋白的结合位点，所述前导聚合物为由碱基基团和无碱基基团形成的单链，所述尾部聚合物为经过修饰或未经过修饰的碱基基团形成的单链；所述构建体的两条链为非共价连接。7.一种表征双链靶多核苷酸的方法，所述方法包括：（a）提供包含具有模板链和互补链的双链靶多核苷酸的构建体，其中所述双链靶多核苷酸在其一端或其附近与类发夹衔接子连接，所述类发夹衔接子包含至少1个双链核酸区；（b）使所述构建体与跨膜孔和多核苷酸结合蛋白接触；（c）提供条件使同一所述构建体的模板链和互补链依次通过跨膜孔；和（d）测量所述双链靶多核苷酸的模板链和互补链分别通过所述跨膜孔期间产生的特征。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述类发夹衔接子如权利要求1至4中任一
项所定义，和/或所述构建体如权利要求5或6中所定义。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法包括使所述构建体与第一多核苷酸结合蛋白和第二多核苷酸结合蛋白接触，所述第一多核苷酸结合蛋白用于分开所述构建体的两条链以及控制所述模板链移动通过所述跨膜孔，所述第二多核苷酸结合蛋白用于控制所述互补链易位通过所述跨膜孔，使整个所述双链靶多核苷酸被表征。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一多核苷酸结合蛋白结合所述前导聚合物上的所述多核苷酸结合蛋白的结合位点，用于依次分开所述前导聚合物和所述尾部聚合物形成的双链、所述靶多核苷酸的双链、所述类发夹衔接子的所述双链核酸区；所述第二多核苷酸结合蛋白结...

【专利技术属性】
技术研发人员：章益，苗卉，孙继国，张周刚，卓远，
申请(专利权)人：北京齐碳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：