一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术为了解决现有的褐藻胶裂解酶突变体无法满足工业化生产需求的问题，使用生物信息学软件，通过同源建模、蛋白质表面氨基酸确定、序列比对等方法确定若干个位于非保守区域的蛋白表面酸性氨基酸，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶的第29位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，得到了一种催化活性/效率提高，温度稳定性好，终产物单一性好，利于减少工业化生产中后续产物的纯化成本的褐藻胶裂解酶突变体，为褐藻胶裂解酶突变体进一步工业化应用奠定了基础。解酶突变体进一步工业化应用奠定了基础。解酶突变体进一步工业化应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于酶工程


技术介绍

[0002]褐藻富含海藻酸盐、海带素、海藻多糖及甘露醇，是一种具有巨大产业价值的海洋作物。其中关于甘露醇和海藻多糖的研究已被广泛报道，相关技术较为成熟。与之不同的是关于海藻酸盐(海藻酸钠)的研究相对较少，加之海藻酸盐由于其分子量大，在水中溶解度低的特点无法被广泛应用。因此，如何实现海藻酸盐的高效降解，并使其实现工业化应用是目前研究的热点。
[0003]海藻酸钠是主要由α
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L
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古罗糖醛酸(G)和β
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D
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甘露糖醛酸(M)通过糖苷键连接的线性多糖，褐藻胶裂解酶(Alginate lyase)能够通过β
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消除反应裂解GM\MG、MM、GG单元间的糖苷键降解海藻酸钠，显著降低其粘度，并最终在降解产物非还原端形成不饱和双键，生成具有优良生理活性的褐藻寡糖。褐藻寡糖具有出色的抗氧化活性，能够通过提高体内抗氧化酶的活性来清除体内的自由基。此外，褐藻寡糖还兼具抑菌与益菌活性。褐藻寡糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌乃至真菌均有一定抑制作用。研究发现，褐藻寡糖对嗜水气单胞菌、白色念球菌具有较强的抗菌作用。与此同时，褐藻寡糖也能够调节肠道菌群，促进益生菌的增值。其优良的生物活性使其愈发成为当下相关研究的热点。
[0004]褐藻胶裂解酶来源广泛，迄今为止已经从多种海洋藻类、海洋软体动物(例如Littorina spp., Haliotis spp.,Turbo cornutus.等)以及一系列的海洋和陆地微生物中鉴定出分属于8个不同家族的褐藻胶裂解酶。然而，由于其来源环境等因素的影响，目前为止能够应用于工业环境中的褐藻胶裂解酶少之又少，大多数褐藻胶裂解酶的性质往往无法满足工业化生产需求。因此，通过基因工程、酶工程手段，对已有的褐藻胶裂解酶进行改造，提高褐藻胶裂解酶的催化性能成为了当前的一个重要研究热点。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了解决现有褐藻胶裂解酶无法满足工业化生产需求的问题，提供了一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，所述技术方案如下：
[0006]本专利技术第一个目的在于提供一种褐藻胶裂解酶突变体，所述突变体是以氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶为亲本，将亲本第29位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，获得的褐藻胶裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所述。
[0007]本专利技术的第二个目的在于提供编码所述褐藻胶裂解酶突变体的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示。
[0008]本专利技术的第三个目的在于提供携带所述基因的质粒。
[0009]本专利技术的第四个目的在于提供表达所述突变体或携带所述基因的重组细胞。
[0010]本专利技术的第五个目的在于提供一种制备褐藻寡糖的方法，所述方法以海藻酸钠水溶液为底物，添加所述褐藻胶裂解酶突变体，催化获得褐藻寡糖。
[0011]在本专利技术的一个实施方式中，所述海藻酸钠水溶液的浓度为0.2％～0.3％，所述褐藻胶裂解酶突变体的添加量为0.9U/g底物～1.2U/g底物。
[0012]在本专利技术的一个实施方式中，所述褐藻胶裂解酶突变体的添加量为1.08U/g底物。
[0013]在本专利技术的一个实施方式中，所述催化是在32℃～35℃反应4h～7h后，终止反应。
[0014]本专利技术的第六个目的在于提供所述的褐藻胶裂解酶突变体，或所述基因在生产褐藻寡糖中的应用。
[0015]本专利技术的第七个目的在于提供一种制备所述褐藻胶裂解酶突变体的方法，所述方法包括如下步骤：
[0016](1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带褐藻胶裂解酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的质粒载体；
[0017](2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
[0018](3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清即为褐藻胶裂解酶突变体的粗酶液。
[0019]在本专利技术的一个实施方式中，所述质粒载体为pET
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28a(+)；所述宿主细胞为大肠杆菌 BL21(DE3)。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]本专利技术获得的褐藻胶裂解酶突变体D29Q酶活较原始酶提高了0.26倍；最适温度为35℃，较原始酶没有明显变化，在35℃保温3h后，残余酶活力在65％以上，具有较好的温度稳定性，有利于连续生产；与原始酶相比，突变体D29Q对海藻酸钠的Km值下降了11％，表明底物亲和力得到一定的增强，且其Kcat/Km值提高了0.38倍，则说明催化效率有所提高。本专利技术所述的褐藻胶裂解酶突变体D29Q用于酶解法制备的褐藻寡糖能够更好的保留寡糖的生物活性，此外，由于本专利技术所述褐藻胶裂解酶突变体及原始酶最终酶解产物均为褐藻三糖(不饱和寡糖)，因此，该方法的最终产物的单一性较好，利于减少工业化生产中后续产物的纯化成本，为褐藻胶裂解酶突变体的进一步工业化应用奠定基础。
附图说明
[0022]图1为定点突变PCR产物图，其中，M为marker，1
‑
8分别为重组质粒pET28a(+)
‑
Aly01， Aly01D29Q，Aly01E203A，Aly01D293G，Aly01E348A，Aly01D463N，Aly01D466N， Aly01E481V的PCR产物；
[0023]图2为纯化后原始酶及各突变体酶蛋白的SDS
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PAGE图，其中，M为marker，1
‑
8分别为纯化后的重组酶pET28a(+)
‑
Aly01，D29Q，E203A，D293G，E348A，D463N，D466N，E481V；
[0024]图3为纯化后原始酶及各突变体的绝对酶活图；
[0025]图4为原始酶Aly01及突变体AlyD29Q在不同pH下的相对酶活图；
[0026]图5为原始酶Aly01及突变体AlyD29Q在不同温度下的相对酶活图；
[0027]图6为原始酶Aly01及突变体AlyD29Q在35℃下保存不同时间的相对酶活图；
[0028]图7为原始酶Aly01及突变体AlyD29Q的解链温度(Tm)图；
[0029]图8为原始酶Aly01及突变体AlyD29Q完全酶解产物的TLC产物分析图，其中，1表示未添加酶；2表示原始酶；3表示突变体D29Q。
具体实施方式
[0030]以下结合实例与附图对本专利技术的具体实施作进一步的说明，以下实例中所使用的质粒、 PCR试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒等采用商业产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。本专利技术的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。
[0031]各培养基的组成：
[0032]LB液体培养基：胰蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种褐藻胶裂解酶突变体，其特征在于，所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶为亲本，将亲本第29位天冬氨酸替换为谷氨酰胺。2.编码权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的质粒。4.表达权利要求1所述突变体或携带权利要求2所述基因的重组细胞。5.一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，以海藻酸钠水溶液为底物，添加权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体，催化获得褐藻寡糖。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述海藻酸钠水溶液的浓度为0.2％～0.3％，所述褐藻胶裂解酶突变体的添加量为0.9U/g底物～1.2U/g底物。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化...

【专利技术属性】
技术研发人员：江波，周力铖，张涛，孟青，陈静静，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：