一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及其应用，属于环境细菌检测与鉴定技术领域。一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。所述引物仅能对微球菌属内物种准确扩增，而对属外物种无法扩增，因此，所述引物对微球菌属内物种具有较强的扩增特异性。本发明专利技术还提供了一种鉴定环境中微球菌的方法，通过荧光等温扩增技术，对环境中微球菌进行快速鉴定，操作简单，对微球菌鉴定范围广，且对微球菌的最低检测限可达60fg/μL，具有较高的检测灵敏度。高的检测灵敏度。高的检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及其应用
[0001]

[0002]本专利技术属于环境细菌检测与鉴定
，具体涉及一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及其应用。

技术介绍

[0003]微球菌属于革兰氏阳性菌，是条件致病菌，能在极端环境下生长，且在一定条件下可引起皮肤局部组织感染，甚至严重感染，造成心内膜炎等疾病。微球菌属有多个分类，其不同的分类在不同的领域有不同的应用。在不同的条件下，不同的微球菌种类可能会对人类生活造成或好或坏的影响，而无论是为了对微球菌的预防还是利用，都需要合适的方法对其进行检测和鉴定。
[0004]16S rDNA基因是细菌中编码rRNA的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，具有良好的进化保守性以及与进化距离相匹配的变异性，是细菌分子鉴定的标准标识序列。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rDNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具，应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便的分类鉴定和检测。
[0005]等温扩增技术是近年来发展起来的新型核酸扩增技术，该技术可以在恒定温度下快速有效地扩增核酸序列。与需要复杂的热循环以介导变性，退火和随后的延伸的PCR方法相比，等温扩增可以在恒温条件下利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶实现对双链DNA的解链、复性和延伸，在5~30分钟即可完成DNA扩增，操作简单，反应时间短，可用于对细菌的快速检测。目前，还没有利用等温扩增技术在属水平鉴定环境微球菌的方法，现有方法主要是利用PCR技术对藤黄微球菌的鉴定，鉴定范围小，技术要求高，灵敏度低，不利于推广。因此，提供一种基于等温扩增技术鉴定环境微球菌的引物、探针和方法具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，能够特异性鉴定微球菌属物种，且具有检测灵敏度高的特点。
[0007]本专利技术的目的还在于提供一种检测环境中微球菌的试剂盒及其应用，具有鉴定范围大、技术要求低的特点，有利于推广应用。
[0008]本专利技术提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。
[0009]本专利技术提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌属的引物探针组，包括所述引物和标记有荧光基团和淬灭基团的探针；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]本专利技术提供了一种鉴定环境中微球菌的试剂盒，包括所述引物或所述引物探针组。
[0011]优选的，所述试剂盒包括检测试剂；所述检测试剂包括recA重组酶蛋白、SSB 蛋白、Bsu DNA聚合酶、核酸外切酶III、2
×
反应缓冲液。
[0012]优选的，所述2
×
反应缓冲液包括以下浓度的组分：200mmol/L的Tricine、220mmol/L 醋酸镁、10mmol/L 二硫苏糖醇、10% PEG、6mmol/L ATP、200ng/μL 肌酸激酶和20mmol/L dNTP。
[0013]优选的，所述试剂盒包括采样液、基因组DNA提取试剂。
[0014]本专利技术提供了所述引物、所述引物探针组、所述试剂盒在鉴定环境中微球菌中的应用。
[0015]本专利技术提供了一种基于等温扩增技术鉴定环境中微球菌的方法，包括以下步骤：1）采集环境样品后，培养获得待检测菌液；2）以提取检测菌液的基因组DNA为模板，在所述引物探针组中的引物和探针的作用下进行等温扩增，采集实时荧光信号，得到荧光扩增曲线；3）根据所述荧光扩增曲线判断环境样品中是否含有微球菌；阴性样品和阳性样品判定标准：荧光阈值设定为0.3，当Ct值＞39时，判定为阴性样品，当Ct值≤39时，判定为阳性样品。
[0016]优选的，所述等温扩增的反应体系如下：在39℃下保持35s，重复40个循环。
[0017]优选的，所述等温扩增的反应程序如下：recA重组酶蛋白
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2~3μgSSB 蛋白
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1.5~2μgBsu DNA 聚合酶
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0.5~1μg核酸外切酶III
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0.8~1.6U2
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反应缓冲液
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10μL10μM正向引物/10μM反向引物
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0.8μL/0.8μL5μM探针
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0.5μLDNA模板
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2μLddH2O
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补足至20μl。
[0018]本专利技术提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。所述引物仅能对微球菌属内物种准确扩增，而对属外物种无法扩增，因此，所述引物对微球菌属内物种具有较强的鉴定特异性，实现微球菌的鉴定。同时灵敏度检测实验结果表明，所述引物对微球菌的最低检测限可达60fg/μL，具有较高的检测灵敏度。
[0019]本专利技术还提供了一种基于等温扩增技术鉴定环境中微球菌的方法，基于上述方案的引物和探针进行等温扩增，采用荧光扩增曲线判断环境样品中是否含有微球菌，具有反应时间短、操作简单，对样品检测快速的特点，并且在微球菌属内实现鉴定，鉴定范围广，检测灵敏度可达60fg/μL，检测灵敏度高，推广应用性强。
附图说明
[0020]图1为本专利技术提供的基于等温扩增技术鉴定环境中微球菌的技术流程图；图2为微球菌扩增序列比对结果；图3A为环境中分离的各菌种的特异性检测结果；图3B为各标准菌株的特异性检测结果；图4A为藤黄微球菌灵敏度检测结果；图4B为环境分离的微球菌灵敏度检测结果；图5为混合菌鉴定结果。
具体实施方式
[0021]本专利技术提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1（5'
‑
GATTTATCGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATC
‑
3'）所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2（5'
‑ꢀ
GTGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGC
‑
3'）所示的反向引物。本专利技术对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物人工合成方法即可。在本专利技术实施例中，所述引物委托生工生物工程股份有限公司合成。
[0022]本专利技术提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物探针组，包括所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。2.一种基于等温扩增技术鉴定微球菌属的引物探针组，其特征在于，包括权利要求1所述引物和标记有荧光基团和淬灭基团的探针；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.一种鉴定环境中微球菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物或权利要求2所述引物探针组。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测试剂；所述检测试剂包括recA重组酶蛋白、SSB 蛋白、Bsu DNA 聚合酶、核酸外切酶III、2
×
反应缓冲液。5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述2
×
反应缓冲液包括以下浓度的组分：200mmol/L的Tricine、220mmol/L 醋酸镁、10mmol/L 二硫苏糖醇、10% PEG、6mmol/L ATP、200ng/μL 肌酸激酶、20mmol/L dNTP。6.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括采样液、基因组DNA提取试剂。7.权利要求1所述引物、权利要求2所述引物探针组、权利要求3~6任意一项所述试剂盒在鉴定环境中微球菌中的应用。8.一种基于等温扩增技术鉴定环境中微球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）采集环境样品后，培养获得待检测菌液；2）以提取检测菌液的基因组DNA为模板，在权利要求2所述引物探针组中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：至微生物智能科技厦门有限公司，
类型：发明
国别省市：