一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR-Cas12a系统及应用技术方案

本发明专利技术涉及医疗技术领域，提供了一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。所述CrRNA用于引导Cas12a蛋白识别并结合到经LAMP扩增的序列上以切割靶序列，同时，Cas12a蛋白反式切割反应体系内的任一单链DNA。本发明专利技术还提供了一种CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR
‑
Cas12a系统及应用


[0001]本专利技术涉及医疗
，尤其涉及一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR
‑
Cas12a系统及应用。

技术介绍

[0002]肺炎克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上。肺炎克雷伯菌感染人体后会出现咳嗽、咳痰、发热、寒战、呼吸困难等症状，其携带的“碳青霉烯酶类耐药基因”对抗生素的耐药性是目前全球关注的热点问题。这类耐药菌在医院内传播力强，引起的感染临床治疗手段有限，且效果不佳。因此，如何快速、有效、方便的进行分子检测至关重要，也是目前急需解决的问题。
[0003]目前，这类菌株在临床上的药敏检测方法包括纸片扩散法、E
‑
test、肉汤微量稀释法以及微生物自动化药敏检测法；表型检测方法包括CarbaNP试验、mCIM试验(改良碳青霉烯灭活试验)和eCIM试验(EDTA碳青霉烯灭活试验)试验、酶抑制剂增强试验等；基因型检测方法包括PCR、多重PCR、巢式PCR、RT
‑
PCR和微流控技术相结合来检测基因型或者通过测序来鉴定；由于需要昂贵的实验室仪器，而且这些方法所需时间均较长、操作复杂，普通实验室也很难开展。
[0004]为了满足快速和廉价诊断的需求，我们开发了一种基于CRISPR
–
Cas12a技术设计出的CrRNA与CRISPR
‑
Cas12a系统，同时与免疫层析条耦联开发了一种快速(30
‑
40分钟)检测临床样本中碳青霉烯酶的方法，对于临床快速诊断至关重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种用于碳青霉烯酶检测的用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR
‑
Cas12a系统及应用。
[0006]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0007]一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]作为本专利技术的优选方式之一，所述CrRNA用于引导Cas12a蛋白识别并结合到经LAMP扩增的序列上以切割靶序列，同时，Cas12a蛋白反式切割反应体系内的任一单链DNA。
[0009]一种CrRNA在制备碳青霉烯酶检测产品中的应用。
[0010]一种检测碳青霉烯酶的CRISPR
‑
Cas12a系统，包括上述crRNA。
[0011]作为本专利技术的优选方式之一，具体包括Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素
‑
猝灭剂双标记探针、LAMP扩增产物，或者，包括Cas12a蛋白、crRNA、荧光素
‑
生物素双标记探针、LAMP扩增产物。
[0012]作为本专利技术的优选方式之一，所述LAMP扩增产物的扩增引物包括引物F3、引物B3、引物BIP、引物FIP、引物LB、引物LF，其序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。
[0013]作为本专利技术的优选方式之一，所述系统还包括LAMP扩增体系和Cas12a裂解反应体系所需试剂。
[0014]作为本专利技术的优选方式之一，所述LAMP扩增体系如下：引物F3(0.2μM)、引物B3(0.2μM)、引物BIP(1.6μM)、引物FIP(1.6μM)、引物LB(0.4μM)、引物LF(0.4μM)、1.4mM dNTP、6mM MgSO4、1
×
等温扩增缓冲液、320U/mL Bst 2.0温启动DNA聚合酶、异硫氰酸荧光素、2μL靶DNA模板，并添加ddH2O至最终体积25μL。LAMP扩增条件为：阶段一：65℃扩增，1min；40个循环；阶段二：4℃保温。
[0015]作为本专利技术的优选方式之一，所述Cas12a裂解反应体系(25μL)如下：5μL NEB 3.1缓冲液、3μL crRNA(10μM)、1μL LbCas12a(40nM)、1μL异硫氰酸荧光素
‑
猝灭剂双标记探针(60nM)、3ul LAMP扩增产物、ddH2O 12μL。
[0016]或者，所述Cas12a裂解反应体系(25μL)如下：5μL NEB 3.1缓冲液、3μLcrRNA(10μM)、1μL LbCas12a(40nM)、1μL荧光素
‑
生物素双标记探针(60nM)、3ul LAMP扩增产物、12μL ddH2O。
[0017]一种基于CRISPR
‑
Cas12a快速检测碳青霉烯酶的方法，利用上述检测碳青霉烯酶的CRISPR
‑
Cas12a系统对待测样品进行检测。
[0018]作为本专利技术的优选方式之一，当所述CRISPR
‑
Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素
‑
猝灭剂双标记探针和LAMP扩增产物时，通过观察Cas12a裂解反应后切割产物的荧光值来读取检测结果；
[0019]当所述CRISPR
‑
Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、荧光素
‑
生物素双标记探针和LAMP扩增产物时，通过Cas12a裂解反应后的切割产物与胶体金免疫层析条的耦联反应，来读取检测结果。
[0020]一种CRISPR
‑
Cas12a系统在制备碳青霉烯酶检测试剂盒中的应用，当所述CRISPR
‑
Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素
‑
猝灭剂双标记探针和LAMP扩增产物时，该试剂盒用于室内荧光检测；当所述CRISPR
‑
Cas12a系统采用Cas12a蛋白、crRNA、荧光素
‑
生物素双标记探针和LAMP扩增产物时，该试剂盒用于室外低资源条件下的免疫层析条快速检测。
[0021]本专利技术相比现有技术的优点在于：
[0022](1)本专利技术的CrRNA可引导Cas12a蛋白结合到靶序列上识别并切割靶序列，同时，切割在反应体系的单链DNA报告分子；当单链DNA报告分子为异硫氰酸荧光素
‑
猝灭剂双标记探针时，可配合荧光检测仪器直接读取检测结果；当单链DNA报告分子为荧光素
‑
生物素双标记探针时，可配合免疫层析条读取检测结果；据此，本专利技术可作为临床大规模检测人群的方法，且相对传统诊断检测方式，本专利技术检测方式既大大地缩短了检测时间，也不需要反复训练的操作人员，同时秏价低。
[0023](2)本专利技术建立在等温扩增的基础上，结合CRISPR
‑
Cas12a的快速检测平台，为临床分子水平快速诊断的研究奠定坚实的理论基础。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的用于碳青霉烯酶检测的CrRNA，其特征在于，所述CrRNA用于引导Cas12a蛋白识别并结合到经LAMP扩增的序列上以切割靶序列，同时，Cas12a蛋白反式切割反应体系内的任一单链DNA。3.一种如权利要求1
‑
2任一所述的CrRNA在制备碳青霉烯酶检测产品中的应用。4.一种检测碳青霉烯酶的CRISPR
‑
Cas12a系统，其特征在于，包括如权利要求1
‑
2任一所述crRNA。5.根据权利要求4所述的检测碳青霉烯酶的CRISPR
‑
Cas12a系统，其特征在于，具体包括Cas12a蛋白、crRNA、异硫氰酸荧光素
‑
猝灭剂双标记探针、LAMP扩增产物，或者，包括Cas12a蛋白、crRNA、荧光素
‑
生物素双标记探针、LAMP扩增产物。6.根据权利要求5所述的检测碳青霉烯酶的CRISPR
‑
Cas12a系统，其特征在于，所述LAMP扩增产物的扩增引物包括引物F3、引物B3、引物BIP、引物FIP、引物LB、引物LF，其序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。7.根据权利要求5所述的检测碳青霉烯酶的CRISPR
‑
Cas12a系统，其特征在于，其特征在于，所述系统还包括LAMP扩增体系和Cas12a裂解反应体系所需试剂。8.一种基于...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈继录，徐华铭，唐浩，夏兆新，杨文苏，朱毅，
申请(专利权)人：安徽医科大学第四附属医院，
类型：发明
国别省市：