一种诱导表达绿色荧光蛋白广宿主质粒的构建及其在荧光示踪中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种诱导表达绿色荧光蛋白广宿主质粒的构建及其在荧光示踪中的应用。本发明专利技术所述的pBT

【技术实现步骤摘要】
一种诱导表达绿色荧光蛋白广宿主质粒的构建及其在荧光示踪中的应用


[0001]本专利技术为基因工程领域，具体地说，本专利技术涉及到一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的广宿主质粒pBT
‑
iEGFP的构建方法，该质粒可以在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中稳定遗传，在加入无水四环素条件下，可高效表达增强型绿色荧光蛋白。本质粒基于广宿主质粒而构建，可用于多种细菌，不仅仅用于大肠杆菌、沙门菌和布鲁菌的荧光示踪。

技术介绍

[0002]荧光蛋白常用来标记并示踪特定蛋白、病毒或细菌的发光蛋白，与荧光抗体标记相比，其成本低、操作方便、荧光强度高且背景值低等特点。目前市场上用于荧光标记的蛋白较多，如绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白mCherry和DsRed、蓝色荧光蛋白BFP、黄色荧光蛋白YFP等。本专利技术中使用的是增强型绿色荧光蛋白EGFP，其荧光强度更强，更加利于观察。
[0003]大肠杆菌工程菌，如DH5α，是一种常用的用来表达外源蛋白或进行基因工程操作的工具菌种，方便利用化学转化的方法进行基因操作，也方便评估目的基因的表达情况等。禽致病性大肠杆菌是感染家禽的一种重要的细菌性病原，由多种血清学致病性大肠杆菌感染所引起，临床症状包括气囊炎、肝周炎和心包炎等。鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患的病原菌，主要导致食物中毒，在婴幼儿中，病死率较高。布鲁菌同样是一种重要的人畜共患细菌性病原，感染孕畜导致流产，感染人引起波浪热，对公共卫生和畜牧业发展造成巨大影响。
[0004]细菌的荧光标记是一种重要的常见的实验标记技术，用于研究细菌生理生化特性、宿主体内示踪、细菌感染细胞示踪、致病机制研究等。不同种属的细菌，如大肠杆菌、沙门菌和布鲁菌等，通常构建有自己专用的荧光标记质粒，尽管在单独使用时，具有显著的荧光活性，但由于质粒的复制特性，启动子的种类不同，不同细菌需要不同类型的质粒，而且同一质粒在不同种属细菌间不能通用，如在大肠杆菌中能表达荧光的质粒，在布鲁菌中却不能使用，甚至会被降解，而在布鲁菌中能表达荧光的质粒，在大肠杆菌和沙门菌中并不能兼容。此外，市场上用于大肠杆菌、沙门菌和布鲁菌的荧光质粒大多为持续性表达荧光质粒，在感染过程中，无论死菌或活菌都能发出荧光，不能有效区分感染的细菌是活菌还是死菌。因此，构建一个多种细菌通用型的质粒，并可控表达荧光蛋白，可用于示踪感染中的活菌，具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术中的技术缺陷，本专利技术作出如下技术贡献，本专利技术首先提供一种pBT
‑
iEGFP质粒载体，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进一步的，本专利技术提供一种荧光示踪质粒的制备方法，所述方法以广宿主质粒
pBBR1MCS (Kovach ME, Phillips RW, Elzer PH, Roop RM, 2nd, Peterson KM. pBBR1MCS: a broad
‑
host
‑
range cloning vector. BioTechniques, 1994; 16: 800
‑
802.) 为骨架，将阻遏蛋白TetR和四环素启动子Pzt
‑
1和增强型绿色荧光蛋白EGFP串联，构建成一个新的用于可诱导表达绿色荧光蛋白的广宿主质粒pBT
‑
iEGFP。
[0006]进一步的，具体构建方法如下：1）以pZT
‑
EGFP为模板，iEGFP
‑
F 和iEGFP
‑
R为引物，PCR扩增绿色荧光蛋白诱导表达片段TetR
‑
Pzt
‑1‑
iEGFP；2）限制性内切酶KpnI和XbaI双酶切pBBR1MCS质粒，经琼脂糖凝胶电泳后，天根DNA胶回收试剂盒回收线性pBBR1MCS片段；3）无缝克隆试剂盒连接TetR
‑
Pzt
‑1‑
iEGFP片段和pBBR1MCS线性化质粒，产物转化至大肠杆菌DH5α中，PCR鉴定阳性克隆，测定正确的质粒命名为pBT
‑
iEGFP质粒。
[0007]进一步的，本专利技术提供上述构建方法中所使用的引物，其具体序列如下：iEGFP
‑
F: AGGGAACAAAAGCTGGGTACCCCGTTTCCATTTAGGTGGGTA（SEQ ID NO.2）iEGFP
‑
R: CGCGGTGGCGGCCGCTCGATCGATTATTTATTTCCTG（SEQ ID NO.3）进一步的，本专利技术提供一种荧光示踪质粒的应用，所述应用为pBT
‑
iEGFP质粒可以通过化学转化或电转化的方式转化至大肠杆菌工程菌或禽致病性大肠杆菌中，通过无水四环素诱导，涂片后，荧光显微镜观察细菌荧光，体外荧光示踪大肠杆菌。
[0008]进一步的，所述应用具体为：1）大肠杆菌工程菌DH5α化学转化方法：取100
ꢀµ
L大肠杆菌感受态细胞，冰水混合物上慢慢融化，加入20 ng pBT
‑
iEGFP质粒，混合均匀后，冰浴30 min，42 ℃热激90 s，冰浴2 min，加入1 mL LB溶液，37 ℃震荡培养45 min，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆菌株接种氯霉素LB溶液中，分别加入0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL无水四环素诱导12h，取500
ꢀµ
L培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5
‑
10
ꢀµ
L悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。2）禽致病性大肠杆菌AH50电转化方法：LB培养禽致病性大肠杆菌AH50至对数生长前期（OD600= 0.4~0.6），冰浴10 min，无菌预冷水洗涤菌体两遍，预冷的10 %甘油无菌水悬浮细胞，每管分装100
ꢀµ
L，加入1
ꢀµ
g pBT
‑
iEGFP质粒，冰浴10 min，将混合物加入1 mm电转化杯中，1.8 kV 200 Ω条件下，将质粒电转化至禽致病性大肠杆菌AH50中，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆菌株接种氯霉素LB溶液中，分别加入0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL无水四环素诱导12h，取100
ꢀµ
L培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5
‑
10
ꢀµ
L悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。
[0009]进一步的，本专利技术提供一种pBT
‑
iEGFP质粒在鼠伤寒沙门菌荧光示踪中的应用，所述应用为：可以通过电转化的方式转化至鼠伤寒沙门菌中，通过无水四环素诱导，涂片后，荧光显微镜观察细菌荧光，体外荧光示踪沙门菌。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.pBT
‑
iEGFP质粒载体，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的pBT
‑
iEGFP质粒的构建方法，其特征在于，包含如下步骤：1）以pZT
‑
EGFP质粒为模板，iEGFP
‑
F 和iEGFP
‑
R为引物，PCR扩增诱导性表达绿色荧光蛋白片段TetR
‑
Pzt
‑1‑
iEGFP，引物序列如下：iEGFP
‑
F: AGGGAACAAAAGCTGGGTACCCCGTTTCCATTTAGGTGGGTAiEGFP
‑
R: CGCGGTGGCGGCCGCTCGATCGATTATTTATTTCCTG2）使用限制性内切酶KpnI和XbaI双酶切广宿主质粒pBBR1MCS，经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收试剂盒回收线性化pBBR1MCS质粒；3）无缝克隆试剂盒连接TetR
‑
Pzt
‑1‑
iEGFP片段和pBBR1
‑
MCS线性化质粒，产物转化至大肠杆菌DH5α中，PCR鉴定阳性克隆，测定正确的质粒命名为pBT
‑
iEGFP质粒。3.权利要求1所述质粒转化至大肠杆菌属细菌中诱导表达绿色荧光蛋白。其特征在于，包含如下步骤：1）大肠杆菌工程菌DH5α化学转化方法：取100
ꢀµ
L大肠杆菌感受态细胞，冰水混合物上慢慢融化，加入20 ng pBT
‑
iEGFP质粒，混合均匀后，冰浴30 min，42 ℃热激90 s，冰浴2 min，加入1 mL LB溶液，37 ℃震荡培养45 min，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆菌株接种氯霉素LB溶液中，分别加入0~100 ng/mL不同浓度的无水四环素诱导12 h，取500
ꢀµ
L培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5~10
ꢀµ
L悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。2）禽致病性大肠杆菌AH50电转化方法：LB培养禽致病性大肠杆菌AH50至对数生长前期（OD
600
= 0.4~0.6），冰浴10 min，无菌预冷水洗涤菌体两遍，预冷的10 %甘油无菌水悬浮细菌，每管分装100
ꢀµ
L，加入1
ꢀµ
g pBT
‑
iEGFP质粒，冰浴10 min，将混合物加入1 mm电转化杯中，冰浴10 min，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：田明星，于圣青，李子晨，王少辉，尹伊，胡海，丁铲，李涛，祁晶晶，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：