一种基于细胞膜荧光标记的血小板抗体筛查方法及其应用技术

本发明专利技术属于抗体检测技术领域，具体涉及一种基于细胞膜荧光标记的血小板抗体筛查方法及其应用，本发明专利技术血小板抗体筛查方法包括如下步骤：S1：用细胞膜荧光染料对血小板进行荧光标记，得到荧光标记的血小板；S2：向包被有第二抗体的固相载体(U型ELISA板)中加入待检样本孵育；S3：将步骤S1获得的荧光标记的血小板加入孵育后的待检样本中，孵育、离心后直接通过荧光显微镜观察血小板的聚集分布情况，进而判断待检样本中是否含有抗血小板抗体。本发明专利技术筛查方法具有操作简单、省时省力、成本低的优势，更重要的是本发明专利技术血小板抗体筛查方法直接基于荧光标记血小板聚集分布情况来检测血清或血浆中同种抗体，具有较高的检测特异性。具有较高的检测特异性。具有较高的检测特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞膜荧光标记的血小板抗体筛查方法及其应用


[0001]本专利技术属于抗体检测
，具体涉及一种基于细胞膜荧光标记的血小板抗体筛查方法及其应用。

技术介绍

[0002]血小板(Platelet，PLT)表面具有复杂的抗原系统，包括与其它组织或细胞所共有的抗原，如ABO抗原和HLA抗原(HLA
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A，
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B，
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C)；存在于血小板膜糖蛋白上的特异性同种抗原(Human platelet antigens,HPAs)；共同存在于血小板、单核/巨噬细胞以及有核红细胞的GPⅣ/CD36，以及血小板上的胶原受体GP
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。怀孕、输血以及器官移植等方式导致上述血小板相关抗原免疫机体而诱导产生抗体，包括HLA抗体、HPA抗体和CD36抗体等。这些抗体会导致非溶血性发热反应、血小板输注无效、胎儿和新生儿同种免疫血小板减少症、输血后紫癜。为保障临床输血安全和疗效，有效预防输血不良反应和血小板输注无效，节约血液资源，辅助诊断血小板抗体相关免疫性疾病，血小板抗体检测已逐渐成为临床输血前免疫学检测常规。
[0003]目前，血小板抗体检测的方法主要包括如下三种：(1)固相凝集法(solid
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phase red cell adherence,SPRCA)，将富含血小板的血浆加入微量板，使血小板固定在孔底，与被检血清反应，以抗IgG致敏的红细胞指示反应结果。如果血小板上无抗体，则指示细胞聚集在孔底，形成细胞扣，为阴性结果，反之则为阳性。(2)单克隆抗体特异性血小板抗原捕获法(Monoclonal antibody immobilization of platelet antigen assay,MAIPA)，将血小板特异性抗原固定，然后用待检血清与之反应，然后加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的抗人IgG反应、显色，终止反应后测490nm处的吸光度值以此来鉴定血小板特异性抗体，为临床上鉴别免疫性与非免疫性血小板减少提供了特异性诊断方法，可以定量测定血小板抗体，具体如下图1所示。此方法敏感度高、特异性强，即使是血小板上抗原数量很少的HPA
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5抗原，也能检测出，是目前使用最为广泛的方法。(3)抗原捕获酶联免疫吸附试验(Modified antigen capture ELISA,MACE)，将致敏血小板与单克隆的HLA
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I类抗体和GPIIb/IIIa,GPIa/IIa,GPIb/IX,GPIV抗体反应，然后加抗人IgG反应、显色，终止反应后测405nm处的吸光度值，吸光度值等于或大于2倍阴性对照吸光度值的结果即为阳性。此方法特异性较高，操作相对简便，可以检测针对血小板特异性抗原，HLA抗原的IgG抗体，适用于确诊试验和区分血小板抗体类型。
[0004]然而，上述现有技术仍存在如下问题：(1)检测特异性低，假阳性率高。与红细胞不同，血小板是一种无色或淡黄色小块胞质，无论是聚集还是散在的单个血小板，未染色时均不宜通过显微镜或肉眼检出；现有检测技术并不是直接检测血小板与同种抗体的结合情况，而是通过抗IgG致敏的指示红细胞或HRP标记的抗人IgG显色间接反映血小板与同种抗体的结合情况。通过多重抗体或酶联免疫显色的逐级放大，在提高检测敏感性的同时，也大大提高了实验结果的假阳性率，降低了实验的特异性。(2)操作繁琐，耗时长。因现存技术操作流程并不是直接检测血小板和同种抗体的结合情况，而是间接通过抗IgG致敏的指示红
细胞或HRP标记的抗人IgG显色间接反应血小板与同种抗体的结合情况，操作流程繁琐，单人份实验至少要2～3h，耗时较长。(3)成本高。现有技术也涉及多重抗体或酶联免疫显色的放大反应，所需抗体种类较多(2～4种)，除此之外，还需配套相应的指示红细胞或显色底物，成本较高，进而导致检测价格昂贵。

技术实现思路

[0005]针对现有血小板抗体筛查存在的特异性低、操作繁琐耗时长、成本高的问题，本专利技术提供一种基于细胞膜荧光标记的血小板抗体筛查方法及其应用，具有检测特异性高、操作简单省时省力且成本低的优势。
[0006]基于上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种基于细胞膜荧光标记的血小板抗体筛查方法，包括如下步骤：
[0008]S1：用细胞膜荧光染料对血小板进行荧光标记，得到荧光标记的血小板；
[0009]S2：向包被有第二抗体的固相载体中加入待检样本孵育；
[0010]S3：将步骤S1获得的荧光标记的血小板加入孵育后的待检样本中，孵育、离心后直接通过荧光显微镜观察血小板的聚集分布情况，进而判断待检样本中是否含有抗血小板抗体。
[0011]本专利技术血小板抗体筛查方法的工作原理如图2所示，具体如下：首先将特异性的第二抗体包被于U型底ELISA微孔板上，然后将待检血清(或血浆)和LISS(低离子强度溶液)加入相应的微孔中孵育，反应结束后洗涤除去未结合的血清成分，然后加入细胞膜荧光染料标记血小板，孵育、离心，由于本专利技术利用细胞膜荧光标记染料对血小板进行标记，基于血小板表面抗原与待检血清中抗体特异性结合原理，因此，能够直接通过荧光显微镜观察血小板的结合、聚集、分布情况，不同结合程度的血小板呈现不同的荧光特点，从而由荧光显微镜观察到的荧光特点即可判断待检样本中是否含有血小板抗体，而无需通过抗IgG致敏的指示红细胞或HRP标记的抗人IgG显色。
[0012]若待检样本中含有抗PLT同种抗体，即待检样本中含有能够与PLT表面抗原特异性结合的抗体，则会形成第二抗体
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抗PLT同种抗体
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荧光标记PLT表面抗原复合物，该复合物在荧光显微镜下的特点为：荧光位点铺满于U型底反应孔的底部，呈弥漫的荧光，即判定为阳性(如图3所示)。
[0013]若待检样本中不含有抗PLT同种抗体，则不会形成第二抗体
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抗PLT同种抗体
‑
PLT表面抗原复合物，经洗涤去除未结合的血清成分后，剩余物为细胞膜荧光染料标记的血小板，故而在荧光显微镜下的特点为：荧光位点聚集于U型底反应孔的底部，呈现强烈的荧光斑点，即判定为阴性(如图3所示)。
[0014]若待检样本中含有微量的抗PLT同种抗体，则会形成微量的第二抗体
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抗PLT同种抗体
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PLT表面抗原复合物，经洗涤去除未结合的血清成分后，剩余物为细胞膜荧光染料标记的血小板和微量的第二抗体
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抗PLT同种抗体
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PLT表面抗原复合物，其在荧光显微镜下的特点为：荧光位点未铺满U型反应孔的底部，呈弥漫荧光，即判定为弱阳性(如图3所示)。在实际试验中能够依据弥漫性荧光圈的大小可以大致确定检测抗体的阳性程度，如+、2+、3+、4+等，实现对血小板抗体的半定量检测。
[0015]本专利技术血小板抗体筛查方法能够直接在荧光显微镜下观察荧光情况本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞膜荧光标记的血小板抗体筛查方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：用细胞膜荧光染料对血小板进行荧光标记，得到荧光标记的血小板；S2：向包被有第二抗体的固相载体中加入待检样本孵育；S3：将步骤S1获得的荧光标记的血小板加入孵育后的待检样本中，孵育、离心后直接通过荧光显微镜观察血小板的聚集分布情况，进而判断待检样本中是否含有抗血小板抗体。2.根据权利要求1所述血小板抗体筛查方法，其特征在于，所述细胞膜荧光染料包括PKH 26、PKH 67、1,1
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dioctadecyl
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3,3,3
′3′‑
tetramethylindocarbocyanine perchlorate或3,3
′‑
dihexadecyloxacarbocyanine perchlorate。3.根据权利要求1所述血小板抗体筛查方法，其特征在于，所述第二抗体为小鼠抗人IgG多克隆抗体、兔抗人IgG多克隆抗体、羊抗人IgG多克隆抗体、小鼠抗人IgG单克隆抗体、兔抗人IgG单克隆抗体、羊抗人IgG单克隆抗体或重组的抗人IgG抗体。4.根据权利要求1所述血小板抗体筛查方法，其特征在于，所述固相载体为U型底ELISA微孔板。5.根据权利要求1所述血小板抗体筛查方法，其特征在于，所述待检样本为待检血清或血浆样...

【专利技术属性】
技术研发人员：苑召虎，魏亚明，谌丹丹，
申请(专利权)人：广州市第一人民医院广州消化疾病中心，广州医科大学附属市一人民医院，华南理工大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：