催化糖链延伸的糖基转移酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及负责糖链延伸的糖基转移酶突变体的应用。本发明专利技术提供了糖基转移酶突变体，其可以高效催化在四环三萜类化合物的C

【技术实现步骤摘要】
催化糖链延伸的糖基转移酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和植物生物学领域，具体地，本专利技术涉及一组糖基转移酶及其应用。

技术介绍

[0002]人参皂苷是从人参属植物(如人参、三七和西洋参等)和绞股蓝中分离到的皂苷的总称，是一类三萜化合物。人参皂苷亦可以根据其分离的来源称为人参皂苷，三七皂苷和绞股蓝皂苷。人参皂苷是这些药用植物中的主要生物活性成份。目前，已经分离出了约150种皂苷。从结构上来看，人参皂苷主要是皂苷元经过糖基化后形成的生物活性小分子。人参皂苷的皂苷元只有有限的几种，主要是达玛烷型四环三萜的原人参二醇和原人参三醇，以及齐墩果烷酸。皂苷元通过糖基化后，可以提高水溶性，改变其亚细胞定位，并产生出不同的生物活性。绝大部分原人参二醇型皂苷是在C3和/或C20位羟基进行糖基化修饰，而原人参三醇型皂苷是在C6和/或C20的羟基上进行糖基化修饰。不同类型的糖基以及不同程度的糖基化修饰产生了分子结构繁多的人参皂苷。
[0003]鼠李糖基化修饰的人参皂苷具有丰富的生物活性。例如Rg2是在Rh1的C6-O-Glc延伸一分子鼠李糖，Rg2在治疗抑郁、改善心功能、提高学习记忆能力、抗老年痴呆等方面具有很好功效；人参皂苷Re是在Rg1的C6-O-Glc延伸一分子鼠李糖，可能通过促进肠道组织中胰高血糖素样肽-1的分泌来发挥降血糖、治疗糖尿病的作用。
[0004]人参皂苷以人参或者三七的总皂苷或者丰富皂苷为原料，依赖化学、酶和微生物发酵的水解方法进行制备。由于野生的人参资源已基本耗竭，人参皂苷资源目前来源于人参或三七的人工栽培，而其人工栽培的生长周期长(一般需要5-7年以上)，并且受到地域的限制，还经常受到病虫害而需要施用大量的农药，所以，人参或三七的人工栽培有严重的连作障碍(人参或三七种植地需要休耕5-15年以上才能克服连作障碍)，所以人参皂苷的产量、品质及安全性都面临挑战。
[0005]合成生物学的发展为植物来源的天然产物的异源合成提供了新的机遇。以酵母为底盘，通过代谢途径的组装和优化，已经实现了用廉价的单糖来发酵合成青蒿酸或者双氢青蒿酸，继而再通过一步化学转化的方法生产青蒿素，这表明合成生物学在天然产物的药物合成方面具有的巨大潜力。利用酵母底盘细胞通过合成生物学方法异源合成人参皂苷单体，原料为廉价的单糖，制备过程为安全性可调控的发酵过程，避免了任何外来污染(例如，原料植物人工种植时使用的农药)。因此，通过合成生物学技术制备人参皂苷单体，不仅具有成本优势，而且，可以保证成品的品质与安全性。利用合成生物学技术制备足够量的各种高纯度的天然与非天然的人参皂苷单体，用于活性测定及临床实验，促进稀有人参皂苷的创新药物研发。
[0006]近年来通过对人参、三七和西洋参的转录组和功能基因组研究，人参皂苷皂苷元合成途径的解析已经有了非常大的进展。2006年，日本和韩国科学家分别鉴定了将环氧角鲨烯转化为达玛烯二醇的萜环化酶元件(达玛烯二醇合成酶，PgDDS)。2011年到2012年，韩
国科学家又鉴定了把达玛烯二醇氧化为原人参二醇以及把原人参二醇进一步氧化为原人参三醇的细胞色素P450元件CYP716A4和CYP716A53v2。
[0007]利用合成生物学方法来人工合成这些具有药用活性的人参皂苷，不仅需要构建合成皂苷元的代谢途径，还需要鉴定催化人参皂苷的糖基化的UDP-糖基转移酶。UDP-糖基转移酶的功能是将糖基供体(核苷二磷酸糖，例如UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和UDP-阿拉伯糖)上的糖基转移到不同的糖基受体上。从目前已测序的植物基因组分析，植物基因组往往编码了上百种以上不同的糖基转移酶。2015年中国学者鉴定了能在原人参三醇C6位转入一个葡萄糖基的UDP-糖基转移酶元件(UGTPg100)。中国学者在专利(PCT/CN2015/081111)公开了可以在原人参三醇型皂苷的C6位进行糖链延伸的糖基转移酶(gGT29-7等)，如gGT29-7可以利用UDP-Xyl催化Rh1的C6位延伸一分子木糖基生成三七皂苷R2，可以利用UDP-Glc催化Rh1的C6位延伸一分子葡萄糖糖基生成人参皂苷Rf，但基本无法利用UDP-Rha催化Rh1的C6位延伸一分子鼠李糖基生成人参皂苷Rg2；虽然后续专利(PCT/CN2015/081111)公开的gGT29-7的突变体gGT29-7(N343G，A359P)能够利用UDP-Rha催化Rh1的C6位延伸一分子鼠李糖基生成Rg2，但活性非常低，仅大约9％转化率，不能完全满足应用的需求。
[0008]因此，本领域还需要开发进一步优化的糖基转移酶。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了高效的糖基转移酶及其应用，用于催化四环三萜类化合物糖基化反应。
[0010]在本专利技术的第一方面，提供糖基转移酶的突变体，所述突变体包括：(a)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:12(野生型gGT29-7)，发生第362位、第15位和/或第54位的突变；或，氨基酸序列对应于SEQ ID NO:12，发生第362位、第15位和/或第54位的突变，且发生第343位和第359位的突变；(b)将(a)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；(c)与(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；(d)(a)～(c)任一所述蛋白的活性片段，其包含糖基转移酶gGT29-7空间结构中与糖基供体、糖基受体相互作用的结构，且在对应于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；或，(e)(a)～(d)任一所述蛋白的两端添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后形成的蛋白。
[0011]在一个或多个实施方案中，所述的糖基转移酶突变体中，第362位突变为Tyr(Y)、第15位突变为Trp(W)和/或第54位突变为Met(M)；或，所述的第343位突变为Gly(G)，第359位突变为Pro(P)。
[0012]在一个或多个实施方案中，(a)中，所述突变体具有SEQ ID NO:10、4、6、8或所示的氨基酸序列。
[0013]在本专利技术的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的核酸是编码所述的糖基转移
酶突变体。
[0014]在一个或多个实施方案中，所述的多核苷酸选自以下的一种或多种：(A)编码如SEQ ID NO:10、4、6、8所示多肽或其衍生多肽的核苷酸序列；(B)如SEQ ID NO:9、3、5、7所示的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.糖基转移酶的突变体，所述突变体包括：(a)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:12，发生第362位、第15位和/或第54位的突变；或，氨基酸序列对应于SEQ ID NO:12，发生第362位、第15位和/或第54位的突变，且发生第343位和第359位的突变；(b)将(a)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；(c)与(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；(d)(a)～(c)任一所述蛋白的活性片段，其包含糖基转移酶gGT29-7空间结构中与糖基供体、糖基受体相互作用的结构，且在对应于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；或(e)(a)～(d)任一所述蛋白的两端添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后形成的蛋白。2.如权利要求1所述的糖基转移酶的突变体，其特征在于，所述的糖基转移酶突变体中，第362位突变为Tyr、第15位突变为Trp和/或第54位突变为Met；或，所述的第343位突变为Gly，第359位突变为Pro。3.如权利要求1所述的糖基转移酶的突变体，其特征在于，(a)中，所述突变体具有SEQ ID NO:10、4、6、8或所示的氨基酸序列。4.分离的多核苷酸，所述的核酸是编码权利要求1所述的糖基转移酶突变体。5.一种核酸构建物或载体，它含有权利要求4所述的多核苷酸，或表达权利要求1所述的糖基转移酶的突变体。6.一种遗传工程化的宿主细胞，它含有权利要求5所述的核酸构建物或载体，或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸，或表达权利要求1所述的糖基转移酶的突变体。7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞中包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞；较佳地，所述真核细胞包括酵母细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；较佳地，所述植物细胞包括人参细胞或三七细胞。8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，其还表达达玛烯二醇和/或原人参二醇型皂苷和/或原人参三醇型皂苷合成代谢途径中关键酶；或，所述宿主细胞还包括达玛烯二醇和/或原人参二醇型皂苷和/或原人参三醇型皂苷合成代谢途径中的关键酶的编码基因或含有所述编码基因的核酸构建物。9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的原人参三醇型皂苷包含人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re4、三七皂苷R3、三七皂苷Fp1、西洋参皂苷L17、人参皂苷Rg2、人参皂苷Re、Floralgensenoside M、Yesanchinoside E、Floralgensenoside N、Floralquinquenoside E。10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述的人参皂苷Rh1合成代谢途径中的关键基因包括：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450 CYP716A47基因和P450 CYP716A47
的还原酶基因和四环三萜C6的糖基转移酶UGTPg100，或其组合；或所述的人参皂苷Rg1合成代谢途径中的关键基因包括：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450 CYP716A47基因和P450 CYP716A47的还原酶基因和四环三萜C20位和C6的糖基转移酶UGTPg1和UGTPg100，或其组合；或所述的人参皂苷Rg2合成代谢途径中的关键基因包括：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450 CYP716A47基因和P450 CYP716A47的还原酶基因和四环三萜C6的糖基转移酶UGTPg100以及本文中催化C6位糖基延伸的糖基转移酶，或其组合；或所述的人参皂苷Re合成代谢途径中的关键基因包括：达玛烯二醇合成酶基因、细胞色素P450 CYP716A47基因和P450 CYP716A47的还原酶基因和四环三萜C20位和C6的糖基转移酶UGTPg1和UGTPg100以及本文中催化C6位糖基延伸的糖基转移酶，或其组合。11.权利要求1～3任一所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志华，李超静，严兴，王平平，杨成帅，
申请(专利权)人：周志华，
类型：发明
国别省市：