本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及细胞色素P450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用。本发明专利技术获得的CYP基因GL20421可催化灵芝酸HLDOA形成一种新的天然灵芝三萜产物-式(I)所示的灵芝三萜类化合物；本发明专利技术获得的CYP基因GL21117可催化灵芝酸HLDOA形成的灵芝酸Jb，其与天然的化合物结构完全一致，具有同等的产品性能和质量。本发明专利技术通过将GL20421和GL21117基因在酿酒酵母中异源表达，实现了灵芝三萜类化合物异源生物合成，产率高，具有广泛的应用前景。景。景。
【技术实现步骤摘要】
al.,Trends in Biotechnology,2019.37(6):618-631)，通过代谢工程改造灵芝真菌实现灵芝三萜类化合物产量的大幅提高也具有极大的挑战和困难。目前，灵芝三萜的相关研究都停留在实验室阶段，鲜有成药报道。挖掘新型灵芝三萜类化合物，降低成本以提高灵芝三萜类化合物的生产效率，成为科研工作者面临的两大课题。
[0007]合成生物学的发展和酿酒酵母模式生物的深入研究为灵芝三萜类化合物的挖掘和开发提供了一种非常有潜力的途径。酿酒酵母具有基因组序列明确、有丰富的基因操作手段、含有多种三萜化合物生物合成的前体、内质网和翻译后修饰系统利于真核基因表达等特点，在异源表达真菌类、植物类来源天然产物生物合成基因尤其是细胞色素P450酶方面具有其他微生物无可比拟的显著优势(Xiao,H.,et al.,Trends in Biotechnology,2019.37(6):618-631)，得到了国内外科学家的广泛认同和采用(Lan,X.,et al.,Biotechnol Bioeng,2019.116(12):3301-3311；Ajikumar,P.K.,et al.,Mol Pharm,2008.5(2):167-90；Dai,Z.,et al.,Sci Rep,2014.4:3698；Yan,X.,et al.,Cell Res,2014.24(6):770-3)。利用合成生物学的技术手段，对酿酒酵母进行改造，将灵芝中可能与灵芝三萜类化合物合成相关的基因导入酿酒酵母中进行表达，实现对灵芝中新型灵芝三萜类化合物的深入挖掘及灵芝三萜类化合物的异源生物合成成为可能。
[0008]研究表明，灵芝细胞内通过甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway)合成羊毛甾醇(Lanosterol)，通过同位素示踪技术研究表明，羊毛甾醇是灵芝三萜的直接生物合成前体(Yeh,S.-f.Proc Natl Sci Council ROC(B).1989)。细胞色素P450酶CYP5150L8能够催化羊毛甾醇，经过三步氧化反应形成一种灵芝三萜HLDOA(Ganoderic acid HLDOA)(Wang,W.F.,et al.,Biotechnol Bioeng,2018.115(7):1842-1854)。而灵芝三萜类化合物的其他生物合成基因仍未可知。
技术实现思路
[0009]针对现有人工栽培灵芝或灵芝深层发酵的宿主生长缓慢等不足，本专利技术提出一种基于合成生物学策略发现新颖灵芝三萜类化合物并实现其异源生物合成的方法，具体来讲是通过挖掘鉴定和灵芝三萜生物合成相关的细胞色素P450酶基因，并在酿酒酵母细胞中异源表达，从而实现灵芝三萜类化合物的异源生物合成。
[0010]本专利技术提供如下技术方案：
[0011]本专利技术首先提供编码细胞色素P450酶或其催化活性片段的核酸分子，包括如SEQ ID No.1(GL20421基因)或SEQ ID No.3(GL21117基因)所示的核苷酸序列。
[0012]本专利技术还提供一种细胞色素P450酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID NO.4所示；或者，与SEQ ID No.2或SEQ ID NO.4具有65％以上的同源性，例如70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或者99％以上的同源性，且仍保持催化活性。
[0013]本专利技术所提供的核酸分子或所述核酸分子编码的细胞色素P450酶具有催化灵芝酸生成灵芝三萜类化合物的活性，可以实现灵芝三萜类化合物的异源生物合成。
[0014]本专利技术还提供一种重组的宿主细胞，其编码本专利技术提供的任意一种细胞色素P450酶的异源核酸分子。在一个实施方案中，所述重组的宿主细胞编码SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，例如所述重组的宿主细胞通过编码上述核苷酸序列表达如SEQ ID No.2或SEQ ID NO.4所示的细胞色素P450酶。
[0015]根据本专利技术的实施方案，所述重组的宿主细胞是通过本领域已知的技术手段将宿主细胞进行改造，使其能够产生灵芝三萜类化合物。例如，可以通过同源重组、基因编辑或本领域已知的其他基因重组技术将本专利技术提供的核酸分子导入到宿主细胞中，实现宿主细胞的改造或修饰。
[0016]根据本专利技术的实施方案，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞，例如，细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。例如，所述宿主细胞是酵母属(Saccharomycesgenus)细胞、毕赤酵母属(Pichiagenus)细胞或大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞。
[0017]本专利技术进一步提供上述核酸分子或者细胞色素P450酶或者重组的宿主细胞在合成灵芝三萜类化合物中的应用。
[0018]根据本专利技术的实施方案，所述灵芝三萜类化合物为式(I)或式(II)所示的化合物：
[0019][0020]根据本专利技术的实施方案，GL20421基因或其编码的细胞色素450酶或含有该基因的宿主细胞用于合成式(I)所示的灵芝三萜类化合物。
[0021]根据本专利技术的实施方案，GL21117基因或其编码的细胞色素450酶或含有该基因的宿主细胞用于合成式(II)所示的灵芝三萜类化合物。
[0022]本专利技术还提供一种灵芝三萜类化合物的合成方法，包括：将本专利技术所述的细胞色素P450酶与灵芝酸HLDOA接触，生成灵芝三萜类化合物。
[0023]在一个实施方案中，所述灵芝三萜类化合物为式(I)或式(II)所示的化合物。
[0024]本专利技术还提供式(I)所示的化合物的合成方法，包括：氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的细胞色素P450酶与灵芝酸HLDOA接触，生成式(I)所示的化合物。
[0025]本专利技术还提供式(II)所示的化合物的合成方法，包括：氨基酸序列如SEQ ID No.4
所示的细胞色素P450酶与灵芝酸HLDOA接触，生成式(II)所示的化合物。
[0026]根据本专利技术的实施方案，所述合成方法为异源生物合成方法。具体来说，所述异源生物合成方法包括培养本专利技术所述的重组的宿主细胞，表达所述细胞色素P450酶，并催化灵芝酸HLDOA生成所述灵芝三萜类化合物。
[0027]根据本专利技术的实施方案，所述合成方法还包括从重组的宿主细胞的培养物中分离所述灵芝三萜类化合物。
[0028]根据本专利技术的实施方案，所述重组的宿主细胞为重组的酿酒酵母，通过发酵方式培养所述酿酒酵母，从发酵液中分离所述灵芝三萜类化合物。
[0029]在一个实施方案中，所述重组的酿酒酵母包括含有SEQ ID No.1(GL20421基因)或SEQ ID No.3(GL21117基因)所示核苷酸序列的重组质粒；所述重组质粒含有表达载体、SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列、启动子、终止子等表达元件。例如，所述重组质粒由表达载体pRS426、本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.编码细胞色素P450酶或其催化活性片段的核酸分子，其特征在于，包括如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。2.一种细胞色素P450酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID NO.4所示；或者，与SEQ ID No.2或SEQ ID NO.4具有65％以上的同源性。3.一种重组的宿主细胞，其特征在于，其包括编码权利要求2所述的细胞色素P450酶的异源核酸分子；优选地，所述重组的宿主细胞是将宿主细胞进行改造，使其能够产生灵芝三萜类化合物；优选地，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞，例如，细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞；例如，所述宿主细胞是酵母属(Saccharomycesgenus)细胞、毕赤酵母属(Pichiagenus)细胞或大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。4.权利要求1所述核酸分子或者权利要求2所述细胞色素P450酶或者重组的宿主细胞在合成灵芝三萜类化合物中的应用；优选地，所述灵芝三萜类化合物为式(I)或式(II)所示的化合物：所述灵芝三萜类化合物为式(I)或式(II)所示的化合物：优选地，SEQ ID No.1所示的核酸分子或其编码的细胞色素450酶或含有该基因的宿主细胞用于合成式(I)所示的灵芝三萜类化合物；优选地，SEQ ID No.3所示的核酸分子或其编码的细...
【专利技术属性】
技术研发人员：王猛，肖晗，袁伟，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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