一种调控番茄侧枝的基因及方法技术

一种调控番茄侧枝的基因及方法，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。本发明专利技术得到的转基因番茄与未转化的番茄相比，通过对植株分枝、叶夹角、花序形态观察，DCD1基因编辑番茄植株具有较少的分支、叶夹角也较野生型更小，花序更加紧凑；侧枝数目平均减少82.14%，叶夹角平均减少35%，花枝长度平均减少67%；所得的转基因番茄，具有适合密植和机械化收割的特性。具有适合密植和机械化收割的特性。具有适合密植和机械化收割的特性。

【技术实现步骤摘要】
一种调控番茄侧枝的基因及方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种调控番茄侧枝的基因及方法。

技术介绍

[0002]番茄(学名：Solanum lycopersicum)，即西红柿，是管状花目、茄科、番茄属的一种一年生或多年生草本植物。番茄原产南美洲，中国南北方广泛栽培。番茄的果实营养丰富，具特殊风味。
[0003]在番茄育种过程中，现代番茄商业化的兴起，主要是由于番茄植株形态的改变，通过培育出多种适合不同种植条件的番茄株型，以满足商业化需要。随着科技的发展，利用转基因技术，实现植物株型的改变，已经成为创制“理想株型”的重要方法。
[0004]CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术目前已经广泛的用于动物、植物和微生物的基因编辑领域。CRISPR/Cas9系统由两部分构成：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)。该系统发挥作用需要sgRNA(small guide RNA)和基因序列上的PAM结构(5
′‑
NGG)指引Cas蛋白发挥核酸内切酶作用。已知的Cas蛋白种类繁多，目前应用最广的Cas9属于Ⅱ型系统：Cas9与sgRNA结合形成复合体，构象发生改变，在sgRNA的引导下，该复合体能够识别基因序列上的PAM位点并锚定到靶位点。在Cas蛋白核酸内切酶的作用下，靶位点产生精确的双链断裂，启动细胞的自我修复机制，导致双链断裂处碱基的缺失插入或错配，进而导致基因突变。/>
技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种适合密植和机械化收割的转基因番茄的培育方法。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种调控番茄侧枝的基因，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种调控番茄侧枝的方法，包括下列步骤：
[0008]步骤1：将接头正向引物F1、接头反向引物R1、接头正向引物F2、接头反向引物R2分别用无菌ddH2O溶解稀释成10μM母液，各取10μL加入到80μL无菌ddH2O中，混合稀释到1μM，然后置于PCR仪中，在85
‑
90℃条件下处理20
‑
40s，然后在室温条件下冷却完成靶点引物退火，得到靶点引物退火产物；
[0009]接头正向引物F1：5'
‑
GTCAGAAGCGAAGCCCATGGAGG
‑
3'；
[0010]接头反向引物R1：5'
‑
AAACCCTCCATGGGCTTCGCTTC
‑
3'；
[0011]接头正向引物F2：5'
‑
GTCACCAGCAACCGTACCCCCAC
‑
3'；
[0012]接头反向引物R2：5'
‑
AAACGTGGGGGTACGGTTGCTGG
‑
3'；
[0013]步骤2：将1μL的pYLgRNA
‑
AtU#质粒混合液、0.5μL步骤1获得的靶点引物退火产物、35U的T4 DNA连接酶、0.5μL的10
×
T4 DNA连接酶反应液和5U的BsaI核酸内切酶混匀，用ddH2O补至10μL体系；PCR条件：37℃，5min；20℃，5min，PCR仪反应5个循环，使靶点引物与
gRNA表达盒连接，扩增gRNA表达盒；
[0014]步骤3：以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2μM的引物U
‑
F和0.2μM的接头反向引物R1与接头反向引物R2组成的混合物，1μL的dNTPs，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5
×
高保真DNA聚合酶反应液和33μL dd H2O，获得第一扩增反应体系，PCR扩增后得到第一扩增产物；以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2μM的引物gRNA
‑
R和0.2μM的接头正向引物F1或接头正向引物F2组成的混合物，1μL的dNTPs，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5
×
高保真DNA聚合酶反应液和33μL dd H2O，获得第二扩增反应体系，PCR扩增后得到第二扩增产物；
[0015]引物U
‑
F：5'
‑
CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
‑
3'；
[0016]步骤4：将位置特异引物B1
’
与位置特异引物B2混合得到PT1特异引物工作液；将位置特异引物B2
’
与位置特异引物BL混合得到PT2L特异引物工作液；将第一扩增产物和第二扩增产物分别稀释，然后各取1μL，混合后得到2μL模板；2μL模板、3μL 10
×
PT1特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5
×
高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第三扩增反应体系，PCR扩增后得到第三扩增产物；2μL模板；3μL 10
×
PT2L特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5
×
高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第四扩增反应体系，PCR扩增后得到第四扩增产物；
[0017]位置特异引物B1
’
：5'
‑
TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG
‑
3'；
[0018]位置特异引物B2：5'
‑
AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC
‑
3'；
[0019]位置特异引物B2
’
：5'
‑
TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG
‑
3'；
[0020]位置特异引物BL：5'
‑
AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC
‑
3'；
[0021]步骤5：将第三扩增产物和第四扩增产物混合，用普通DNA产物纯化试剂盒纯化，最后用无菌ddH2O洗脱，得到纯化后的扩增产物；
[0022]步骤6：向纯化后的扩增产物加入未切割的pYLCRISPR/Cas9
‑
DN质粒，在15μL BsaI内切酶反应液中用10U BsaI内切酶，在37℃条件下酶切，然后再向加入0.4μL的10
×
NEB T4 DNA ligase buffer和35U T4 DNA ligase进行PCR扩增，得到连接产物；然后将连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌DH5α，3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控番茄侧枝的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。2.一种调控番茄侧枝的方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：将接头正向引物F1、接头反向引物R1、接头正向引物F2、接头反向引物R2分别用无菌ddH2O溶解稀释成10μM母液，各取10 μL加入到80 μL无菌ddH2O中，混合稀释到1μM，然后置于PCR仪中，在85
‑
90℃条件下处理20
‑
40s，然后在室温条件下冷却完成靶点引物退火，得到靶点引物退火产物；接头正向引物F1：5'
‑
GTCAGAAGCGAAGCCCATGGAGG
‑
3'；接头反向引物R1：5'
‑
AAACCCTCCATGGGCTTCGCTTC
‑
3'；接头正向引物F2：5'
‑
GTCACCAGCAACCGTACCCCCAC
‑
3'；接头反向引物R2：5'
‑
AAACGTGGGGGTACGGTTGCTGG
‑
3'；步骤2：将1μL的pYLgRNA
‑
AtU#质粒混合液、0.5μL步骤1获得的靶点引物退火产物、35U的T4 DNA 连接酶、0.5μL的10
×
T4 DNA连接酶反应液和5U的BsaI核酸内切酶混匀，用ddH2O补至10μL体系；PCR条件：37℃，5min；20℃，5min，PCR仪反应5个循环，使靶点引物与gRNA表达盒连接，扩增gRNA表达盒；步骤3：以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2 μM的引物U
‑
F和0.2 μM的接头反向引物R1与接头反向引物R2组成的混合物，1μL的dNTPs，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5
×
高保真DNA聚合酶反应液和33μL dd H2O，获得第一扩增反应体系，PCR扩增后得到第一扩增产物；以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2 μM的引物gRNA
‑
R和0.2 μM的接头正向引物F1或接头正向引物F2组成的混合物，1μL的dNTPs，1μL 的高保真DNA聚合酶，10μL的5
×
高保真DNA聚合酶反应液和33μL dd H2O，获得第二扩增反应体系，PCR扩增后得到第二扩增产物；引物U
‑
F：5'
‑
CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
‑
3'；gRNA
‑
R：5'
‑ꢀ
CGGAGGAAAATTCCATCCAC
ꢀ‑
3'；步骤4：将位置特异引物B1
’
与位置特异引物B2混合得到PT1特异引物工作液；将位置特异引物B2
’
与位置特异引物BL混合得到PT2L特异引物工作液；将第一扩增产物和第二扩增产物分别稀释，然后各取1μL，混合后得到2μL模板；2μL模板、3μL 10
×
PT1特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5
×
高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第三扩增反应体系，PCR扩增后得到第三扩增产物；2μL模板；3μL 10
×
PT2L特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5
×
高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第四扩增反应体系，PCR扩增后得到第四扩增产物；位置特异引物B1
’
：5'
‑
TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡康棣，张华，姚改芳，孙红叶，孙忱，彭湘君，赵玉琪，宋慧慧，李立霞，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：