一种持续性内切纤维素酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种持续性内切纤维素酶及其编码基因与应用，属于生物工程技术领域。一种基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述基因编码的持续性内切纤维素酶，持续性内切纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术所述持续性内切纤维素酶SmCel5A为一个单结构域的多功能酶，其分子量不足40kD，容易进行异源表达，获得具有内切纤维素酶、外切纤维素酶酶活性的活性蛋白，有效地解决了由于生孢噬纤维菌的生长周期比较长，酶成分比较复杂，不容易对纤维素酶直接进行分离纯化的问题。该酶在生物能源、饲料等行业具广泛的应用潜力。的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种持续性内切纤维素酶及其编码基因与应用


[0001]本专利技术涉及一种持续性内切纤维素酶及其编码基因与应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]纤维素是地球上储量最丰富的碳水化合物资源，也是生物制造产业最重要的可替代原料。开发和利用纤维素质原料来生产生物能源以及各种有用化学品，能够在一定程度上缓解能源危机，实现废物资源化利用，满足当代社会可持续发展的需求。
[0003]纤维素的生物降解通常需要三种酶的协同作用，包括内切纤维素酶(Endoglucanase，EC3.2.1.4)、外切纤维素酶(Cellobiohydrolase，EC3.2.1.91)和β
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葡萄糖苷酶(β
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glucosidase，EC3.2.1.21)。其中，内切纤维素酶作用于纤维素分子内部非结晶区，通过水解β
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1,4
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糖苷键将长链的纤维素大分子截短，产生带还原性末端的小分子纤维素；外切纤维素酶主要作用于纤维素的结晶区域，被认为是纤维素生物降解过程不可或缺的关键酶。但已知有些微生物，如Cytophaga hutchinsonii、Saccharophagus degradans等，能够高效降解纤维素，但基因组序列中却不含有外切纤维素酶的编码基因。研究发现，这些菌株能够编码产生一类特殊的内切纤维素酶，同时具备内切酶和外切酶活性，与β
‑
葡萄糖苷酶协同作用即可高效降解纤维素。近年来，在其它纤维素降解菌株中也陆续发现了一些具有上述催化特性的“双功能酶”，这类特殊的内切酶被定义为“持续性内切纤维素酶(Processive endoglucanase)”。
[0004]纤维素质原料生物转化的主要屏障在于缺乏具有高效水解能力的纤维素酶，往往需要多个酶的协同作用才可以将纤维素降解为可发酵的小分子糖，从而导致酶的成本十分高昂，难以满足工业化生产的需求。持续性内切纤维素酶是一类同时具备内切酶和外切酶功能的双功能纤维素降解酶，可以高效降解纤维素为纤维二糖等小分子，与β
‑
葡萄糖苷酶协同作用即可完成纤维素糖化过程，大幅度节省酶的成本。因此，开发高效的持续性内切纤维素酶显得尤为重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术的不足，提供一种持续性内切纤维素酶及其编码基因与应用。
[0006]本专利技术提供了一种基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]本专利技术还提供了所述基因编码的持续性内切纤维素酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]进一步地，上述技术方案中，所述持续性内切纤维素酶为一个单结构域的多功能酶，三维结构为经典的GH5家族(β/α)8桶状折叠结构。
[0009]进一步地，上述技术方案中，所述多功能酶为同时具有内切纤维素酶和外切纤维素酶的活性功能。
[0010]本专利技术还提供了一种含所述持续性内切纤维素酶的重组表达工程菌。
[0011]本专利技术还提供了所述持续性内切纤维素酶在降解纤维素中的应用，降解纤维素时，反应pH值为4.5
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6.5，反应温度为20
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60℃。
[0012]进一步地，上述技术方案中，所述反应温度为20
‑
40℃。
[0013]进一步地，上述技术方案中，持续性内切纤维素酶降解纤维素生产葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖，且以纤维二糖为主。
[0014]持续性内切纤维素酶SmCel5A为一个单结构域的多功能酶，三维结构为经典的GH5家族(β/α)8桶状折叠结构，其分子量只有不足40kD，同时具有内切纤维素酶和外切纤维素酶的活性。该酶作用于羧甲基纤维素钠时可使其粘度迅速降低，同时能够水解pNPC生成pNP，表现出持续性内切纤维素酶的特性。作用于滤纸、微晶纤维素等不溶性底物时，产物以纤维二糖为主，同时含有少量单糖、三糖等其它小分子糖；能够与外切酶或普通内切酶协同作用，提高纤维素的水解效率。
[0015]编码基因SmCel5A容易进行异源表达，获得活性蛋白。编码基因SmCel5A装载在pET28a载体上得到重组质粒，然后转入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)宿主中得到工程菌。该重组工程菌株经过发酵培养，超声破碎，镍柱亲和层析柱(Ni
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NTA)纯化后能够得到了大量活性纤维素酶SmCel5A。
[0016]上述持续性内切纤维素酶SmCel5A、编码基因SmCel5A、重组质粒或重组工程菌株在降解纤维素中的应用。
[0017]专利技术有益效果
[0018]本专利技术所述持续性内切纤维素酶SmCel5A为一个单结构域的多功能酶，其分子量不足40kD，容易进行异源表达，获得具有内切纤维素酶、外切纤维素酶酶活性的活性蛋白，有效地解决了由于生孢噬纤维菌(Sporocytophaga myxococcoides)的生长周期比较长，酶成分比较复杂，不容易对纤维素酶直接进行分离纯化的问题。所述持续性内切纤维素酶SmCel5A对羧甲基纤维素钠有较高的水解活力，而对滤纸和磷酸膨胀纤维素的水解活力相对较低，在降解纤维素时，pH值为4.5
‑
6.5，反应温度为20
‑
60℃时，酶活力较高。该酶不具有转糖基功能，最小作用底物为纤维三糖，并可以与β
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葡萄糖苷酶协同降解底物，提高转化率。该酶在生物能源、饲料等行业具广泛的应用潜力。
附图说明
[0019]图1为pET28a质粒结构示意图。
[0020]图2为持续性内切纤维素酶SmCel5A SDS
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中：1泳道为IPTG诱导工程菌超声破碎离心后的上清，2泳道为IPTG诱导后工程菌超声破碎离心后的沉淀，3
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5泳道为洗脱的未与镍柱结合的蛋白，6泳道为纯化后的持续性内切纤维素酶SmCel5A。
[0021]图3为反应温度及反应pH值对持续性内切纤维素酶SmCel5A的内切纤维素酶(以羧甲基纤维素钠为底物)酶活力影响曲线；其中：A为最适反应温度；B为温度稳定性；C为最适反应pH；D为pH稳定性。
[0022]图4为持续性内切纤维素酶SmCel5A降解纤维素产物鉴定；其中：A为TLC检测；B为离子色谱定性检测，C为离子色谱定量检测；其中G1、G2、G3、G4分别代表葡萄糖、纤维二糖、
纤维三糖、纤维四糖。
[0023]图5为持续性内切纤维素酶SmCel5A转糖基功能鉴定；1：葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖混合标准品；2：底物pNPC；3：对照组加入灭活蛋白；4
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8：反应0，5，20，60，120min。
[0024]图6为重组蛋白SmCel5A最小作用底物分析；M：葡萄糖到纤维六糖的混合标准品；1
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4：以纤维而糖为底物的对照组和反应0，20，60min；5
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8：以纤维三糖为底物的对照组和反应0，2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.权利要求1所述基因编码的持续性内切纤维素酶，其特征在于，持续性内切纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.根据权利要求2所述的持续性内切纤维素酶，其特征在于，所述持续性内切纤维素酶为一个单结构域的多功能酶，三维结构为经典的GH5家族(β/α)8桶状折叠结构。4.根据权利要求3所述的持续性内切纤维素酶，其特征在于，所述多功能酶为同时具有内切纤维素酶和外切纤维素酶的活性功能。5.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓艺，赵鑫，王辛，李宪臻，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：