利用植物细胞培养发酵生产沉香的方法及在化妆品的应用技术

本发明专利技术涉及植物细胞培养技术领域，公开一种利用植物细胞培养技术发酵生产沉香的方法及在化妆品中的应用，其步骤包括：培养基的制备、白香木胚性愈伤组织的诱导培养、发酵培养、产物的提取与鉴定、沉香香膏的制备。本发明专利技术采用植物细胞培养技术，实现可悬浮培养胚性愈伤组织的诱导制备，可以为大规模培养提供白香木愈伤组织细胞，进一步利用固体发酵方法制备沉香，操作简单，原料制备高效、后处理污染少，贴近白香木在自然环境下沉香结香过程。本发明专利技术提供的沉香提取物具有优异的舒缓情绪、改善睡眠的功效，可以作为复合型化妆品和/或护肤品添加剂。加剂。加剂。

【技术实现步骤摘要】
利用植物细胞培养发酵生产沉香的方法及在化妆品的应用


[0001]本专利技术涉及植物细胞培养
，具体涉及一种利用白香木胚性愈伤组织经植物细胞培养技术发酵生产沉香的方法及在化妆品中的应用。

技术介绍

[0002]沉香(gaharu、agarwood、eaglewood)是中国、日本、印度、东南亚以及中东国家传统名贵香料和药材，主要来源于瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria)植物，目前公认可以产香的有19个种。现阶段，所有沉香属植物均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)的附录Ⅱ，2020年沉香也被海南省列为继槟榔、椰子、橡胶后的“第四棵树”重点发展。
[0003]白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg.又名土沉香，是我国特有且唯一能产沉香的树种，现已被列入《国家重点保护野生植物名录》、《中国植物红皮书》和《广东珍稀濒危植物》等。
[0004]沉香源于“沉水香”，由于所结香脂丰富，入水即沉，故称为沉香；若所结香脂较少，不可于沉水，则称为黄熟香、栈香。沉香属植物在受到损伤或者刺激时会产生黑色树脂，产生树脂的木质部即为沉香。其形成的机制主要认为是沉香树植物与其内生真菌共同作用的结果。
[0005]沉香是名贵传统中药和天然香料，分布于广东、海南、广西、福建等地，其味辛、苦，具有行气止痛，温中止呕，纳气平喘之功效。《本草纲目》中载沉香可治“心神不足，火不降，水不升，惊悸健忘”，即沉香可治失眠症；还可“风水毒肿，去恶气，主心腹痛，霍乱中恶，邪鬼疰气，清人神”，使人情绪舒缓，精神安定。目前沉香在制药、品香和香料等方面应用都十分广泛。
[0006]沉香属所有种均为濒危物种，与传统的整株材料相比，以白香木植物细胞培养来代替传统的利用木屑发酵生产沉香，对白香木的利用和保护提供了一个新的增长维度。悬浮细胞有生长速度快、细胞活力强、易于控制、实验周期短等优点，被广泛用于生理学、细胞学、生物化学、发育生物学及遗传学、分子生物学的研究。且其分散性和均一性远远优于传统材料，因此实验重复性好，结果更有说服力。采用组织培养方式能为中医药产业和大健康产业提供优质充足的沉香原料，有效促进我国沉香产业的发展。
[0007]沉香形成的机制主要认为是沉香树植物与其内生真菌共同作用的结果，人工诱导实验发现，接种从沉香属植物组织中分离的内生真菌可加速沉香树脂的生成，人工结香作为另一种结香途径，可大大缩短结香时间，满足消费者的需求。
[0008]如何基于现有的植物细胞培养技术上，研究出一种具有产业化前景、生产工艺简单、环境友好型、能大规模生产沉香的方式是一个亟待解决的问题。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是为了开发出一种新的、利用植物细胞培养技术生产沉香的方法并
将其应用于化妆品中，解决传统植株生长周期长、原料资源短缺、受环境影响大等问题，并提供了一种沉香在化妆品应用的新思路。
[0010]本专利技术的技术方案的步骤如下：
[0011]一种利用植物细胞培养技术发酵生产沉香的方法及在化妆品中的应用，其步骤如下：
[0012](1)白香木愈伤细胞诱导培养基的制备
[0013]诱导培养基由B5基础盐培养基、蔗糖20
‑
30g/L、琼脂6
‑
8g/L、肌醇80
‑
120mg/L、6
‑
苄氨基嘌呤(6
‑
BA)2
‑
3.5mg/L、α
‑
萘乙酸(NAA)0.2
‑
0.6mg/L、吲哚
‑3‑
乙酸(IAA)0.4
‑
1.2mg/L、胆碱1
‑
1.8g/L和水组成。
[0014](2)白香木愈伤细胞诱导制备方法
[0015]取白香木植株新发芽的茎段，将茎段进行表面除菌处理后接到步骤(1)制备的诱导培养基中，经培养获得白香木胚性愈伤组织，将分散的胚性愈伤细胞颗粒转接到组培瓶中进行继代培养，后转移至液体摇瓶培养基中，在26℃，115r/min转速下振荡培养15天后，将培养液上清去除50％后补充新鲜培养基进行继代培养；当培养液中干菌体浓度达到25g/L以上，即可通过过滤去除上清，得到白橡木愈伤细胞，经85℃干燥后备用；
[0016]所述组培瓶培养基的组成为：B5培养基3.21g/L，蔗糖30g/L，6
‑
苄氨基嘌呤(6
‑
BA)0.0002g/L，α
‑
萘乙酸(NAA)0.004g/L，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2g/L，琼脂粉8
‑
10g/L，pH 5.8
‑
6.0；
[0017]所述液体摇瓶培养基的组成为：B5培养基3.21g/L，蔗糖30g/L，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2g/L，pH 5.8
‑
6.0。
[0018](3)沉香制备微生物用菌种活化
[0019]挑取保藏于低温冰箱中的菌株镰刀菌(Fusariumsp.A2)(分离自5年龄的白木香结香部位，购买于广东省微生物研究所)少量菌丝体接种到经无菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养液体(PDA)培养基斜面上，28℃培养7天进行菌种活化；
[0020]所述马铃薯葡萄糖琼脂培养液体(PDA)培养基的组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蒸馏水1000ml，pH自然，并预先在115℃条件下灭菌25min后备用；
[0021](4)白香木愈伤细胞微生物发酵培养
[0022]在无菌条件下用大头吸管吸取白香木悬浮细胞，放入白香木细胞液体培养基中。用5mL无菌水冲洗镰刀菌(Fusariumsp.A2)斜面菌种，用大头吸管吸取菌液接种到种子摇瓶中，进行种子培养；将培养好的Fusariumsp.A2种子液按照10％的接种量接种到白香木愈伤细胞的马铃薯葡萄糖琼脂培养液体(PDA)培养基中，在黑暗、27℃环境中放置20天。
[0023]所述液体白香木愈伤细胞培养基的组成为：白香木愈伤细胞20g/L，葡萄糖20g/L，玉米浆1g/L，pH自然，并预先在115℃条件下灭菌25min；
[0024](5)产物的提取与鉴定
[0025]将发酵液用高压匀浆机破碎处理，向细胞破碎的发酵全液中加入95％乙醇浸泡过夜，离心去除沉淀物后，将提取液用旋转蒸发仪蒸发至干，然后用1.5mL氯仿溶解后过0.22μm微孔滤膜后检测鉴定组分。
[0026](6)沉香香膏的制备
[0027]将经组分鉴定的沉香提取物制备成沉香香膏。
[0028]沉香香膏包含以下重量组分的原料：75
‑
85份变性乙醇；2
‑
4份二甘醇；2
‑
4份甘油；4
‑
6份硬脂酸；1
‑
3份沉香提取物；0
‑
0.5份防腐剂；余量为水，调节pH至4.6
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用植物细胞培养技术发酵生产沉香的方法，其特征在于具体包括如下步骤：(1)白香木愈伤细胞诱导培养基的制备诱导培养基由B5基础盐培养基、蔗糖20
‑
30g/L、琼脂6
‑
8g/L、肌醇80
‑
120mg/L、6
‑
苄氨基嘌呤2
‑
3.5mg/L、萘乙酸0.2
‑
0.6mg/L、吲哚
‑3‑
乙酸0.4
‑
1.2mg/L、胆碱1
‑
1.8g/L和水组成；(2)白香木愈伤细胞诱导制备方法取白香木植株新发芽的茎段，将茎段进行表面除菌处理后接到步骤(1)的诱导培养基中，经培养获得白香木胚性愈伤组织，将分散的胚性愈伤细胞颗粒转接到组培瓶中进行继代培养，后转移至液体摇瓶培养基中，在26℃，115r/min转速下振荡培养15天后，将培养液上清去除50％后补充新鲜培养基进行继代培养；当培养液中干菌体浓度达到25g/L以上，即可通过过滤去除上清，得到香木愈伤细胞，经85℃干燥后备用；所述组培瓶培养基的组成为：B5培养基3.21g/L，蔗糖30g/L，6
‑
苄氨基嘌呤0.0002g/L，α
‑
萘乙酸0.004g/L，聚乙烯吡咯烷酮2g/L，琼脂粉8
‑
10g/L，pH 5.8
‑
6.0；所述液体摇瓶培养基的组成为：B5培养基3.21g/L，蔗糖30g/L，聚乙烯吡咯烷酮2g/L，pH 5.8
‑
6.0；(3)沉香制备微生物用菌种活化挑取保藏于低温冰箱中的菌株Fusariumsp.A2少量菌丝体接种到经无菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养液体培养基斜面上，28℃培养7天进行菌种活化；所述液体马铃薯葡萄糖琼脂培养液体培养基的组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蒸馏水1000ml，pH自然，并预先在115℃条件下灭菌25min后备用；(4)白香木愈伤细胞微生物发酵培养在无菌条件下用大头吸管吸取白香木悬浮细胞，放入白香木细胞液体培养基中，用5mL无菌水冲洗Fusariumsp.A2斜面菌种，用大头吸管吸取菌液接种到种子摇瓶中，进行种子培养；将培养好的Fusariumsp.A2种子液按照10％的接种量接种到白香木愈伤细胞的液体马铃薯葡萄糖琼脂培养液体培养基中，在黑暗、27℃环境中放置20天；所述液体白香木愈伤细胞培养基的组成为：白香木愈伤细胞20g/L，葡萄糖20g/L，玉米浆1g/L，pH自然，并预先在115℃条件下灭菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐菱艳，卓之阳，黄健，黄彦宾，孟宪乐，王玥，
申请(专利权)人：爱普香料集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：