一种转染miRNA的细胞膜片及其应用制造技术

本发明专利技术涉及细胞修复技术领域，具体涉及一种转染miRNA的细胞膜片及其应用。一种转染miRNA的细胞膜片，所述细胞膜片由骨髓间充质干细胞组成；所述细胞膜片中MicroRNA let

【技术实现步骤摘要】
一种转染miRNA的细胞膜片及其应用


[0001]本专利技术涉及细胞修复
，具体涉及一种转染miRNA的细胞膜片及其应用。

技术介绍

[0002]传统的基于细胞的骨组织工程是利用大量的种子细胞种植在支架材料上，通过活性因子等诱导细胞分化成骨。其中，骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs) 具有自我更新、多向分化、免疫调节的能力，而且比其他干细胞来源更加广泛、获取更加方便，被认为是优良的诱导骨组织再生的种子细胞。但是，直接将骨髓间充质干细胞等种子细胞种植在支架材料上，存在细胞利用率低、附着效率差和细胞在支架材料上分布不均等缺陷。为解决上述问题，细胞膜片技术应运而生。采用细胞膜片技术，细胞分泌的细胞外基质给细胞提供了组织微环境，可以克服上述单纯细胞种植所带来的缺陷，并且利用细胞膜片技术，骨缺损修复效能明显优于多个单细胞修复。
[0003]虽然将细胞膜片技术应用与骨组织再生中,已经取得了一定的进展，基于细胞膜片的组织再生工程应用已经得到了广泛的认可，但是，仅仅利用细胞膜片技术，对提升种子细胞的骨修复能力的提升效果仍然有限，尚不能满足现阶段的应用需求，已成为限制骨组织工程技术应用于临床的瓶颈。骨组织工程的研究一直致力于维持种子细胞的成骨稳定性、提升支架材料与种子细胞的生物相容性和加强由种子细胞分化成骨的生物机械性能等。需要对细胞膜片微环境的生物信号及分化机制进行更深入的研究，进而充分了解和掌握相关诱导因素的传递和保持的关键技术点，从而提升细胞膜片技术在骨组织再生中的应用价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术意在提供一种转染miRNA的细胞膜片，以解决使用骨髓间充质干细胞修复颌骨缺损的效果不佳的技术问题。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种转染miRNA的细胞膜片，其由骨髓间充质干细胞形成；其细胞中的MicroRNA let
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7a的含量上调。
[0007]采用上述技术方案的原理以及有益效果：
[0008]MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21～23bp的非编码RNA,可通过结合相应靶基因的3'UTR 来调控其转录水平,具有高度的种间保守性,在细胞凋亡、自噬、增殖等生物学进程中起着重要功能。MicroRNA let
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7a(mmu
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let
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7a，MIMAT0000521)是最先被鉴定的miRNA之一，是let
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7家族的一员,且在由药物、感染和应激等因素引起的细胞凋亡中具有重要的抗凋亡作用，但在促进细胞成骨方面尚未报导。专利技术人首次将MicroRNA let
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7a转染到由骨髓间充质干细胞形成的细胞膜片中，使得细胞膜片中的MicroRNA let
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7a表达量上调。利用转染后的细胞膜片与组织工程材料形成复合骨修复材料，实验证明，MicroRNA let
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7a可促进骨髓间充质干细胞成骨，可显著加快模型动物的下颌骨修复进程。
[0009]专利技术人通过建立大鼠颌骨缺损模型，以BMMSCs的多向分化功能、细胞膜片修复技术和miRNA 靶向调控基因为基础，研究let
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7a能否调控BMMSCs细胞膜片的成骨能力，以及转染let
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7a后促进BMMSCs细胞膜片修复颌骨缺损的效果。通过骨髓贴壁培养法得到纯化的BMMSCs，并通过细胞表面抗原标志物鉴定、增殖能力鉴定以及多项分化能力鉴定其干细胞特性。通过诱导使BMMSCs 形成细胞膜片，并随机分组进行转染等后续实验，转染分为三组：let
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7a mimic(mi组)、inhibitor (in组)、negative control(nc组)。联合实时定量PCR和Western Blot技术检测转染有效率；利用实时定量PCR、Western Blot技术、ALP染色以及ALP活性检测、茜素红S染色、HE染色检测BMMSCs细胞膜片转染后体外成骨能力以及对细胞膜片细胞外基质的改变；最后通过将各分组进行体内成骨实验，包括裸鼠皮下异位成骨以及大鼠颌骨缺损原位修复，术后进行HE染色和Micro
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CT分析兴趣区域。通过上述实验，主要发现了：Let
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7a处理BMMSCs膜片，发现mi组较nc组和in组体外成骨以及成细胞外基质相关基因的表达更高，且向成骨细胞分化佳且矿化结节产生增多，其中in组成骨效果最差；Let
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7a处理BMMSCs膜片，转染后各组细胞膜片组织学改变不大，但mi组较nc组和in组体外成细胞外基质相关基因的表达更高，其中in组效果最差； Let
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7a处理BMMSCs膜片后植入裸鼠皮下，发现mi组较nc组和in组骨细胞及骨陷窝增多，新生类骨质产生增多，其中in组效果最差；Let
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7a处理BMMSCs膜片后修复大鼠颌骨缺损，发现 mi组较nc组较in组较control组修复效果更佳，nc组其次，in组仅优于未植入移植物的control 组。
[0010]综上所述，通过大量实验研究可知：let
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7a可以通过促进BMMSCs细胞膜片成骨分化从而改善颌骨缺损修复效果，对探索和建立更好的颌骨缺损修复方式开辟了新的途径。将BMMSCs细胞膜片中MicroRNA let
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7a的含量上调，可有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化，本方案的由骨髓间充质干细胞形成的细胞膜片可以促进下颌骨修复进程。
[0011]进一步，其转染有let
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7a mimic，let
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7a mimic的正义链的序列如SEQ ID NO.2所示，反义链的序列如SEQ ID NO.3所示。通过转染let
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7a mimic可以提高细胞中MicroRNA let
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7a的含量，从而加快细胞膜片的成骨分化的进程。
[0012]进一步，所述骨髓间充质干细胞为P3
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P5代骨髓间充质干细胞。P3
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P5代骨髓间充质干细胞具有较高的生长活性和成骨潜力，故本方案使用这些细胞进行细胞膜片的制备。
[0013]进一步，一种转染miRNA的细胞膜片由如下方法制备：接种并使用完全培养基培养骨髓间充质干细胞，待细胞密度达到70
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80％之后，将完全培养基更换为膜片诱导液培养7天，获得细胞膜片；然后将膜片诱导液更换为含有10％FBS的α
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MEM培养基；再培养一天后，使用let
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7a mimic 转染骨髓间充质干细胞；完成转染后，对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，获得转染miRNA的细胞膜片。
[0014]采用上述技术方案，先将骨髓间充质干细胞诱导成膜，然后使用let
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7a 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：其由骨髓间充质干细胞形成；其细胞中的MicroRNA let
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7a的含量上调。2.根据权利要求1所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：其转染有let
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7a mimic，let
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7a mimic的正义链的序列如SEQ ID NO.2所示，反义链的序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求2所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞为P3
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P5代骨髓间充质干细胞。4.根据权利要求3所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：其由如下方法制备：接种并使用完全培养基培养骨髓间充质干细胞，待细胞密度达到70
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80％之后，将完全培养基更换为膜片诱导液培养7天，获得细胞膜片；然后将膜片诱导液更换为含有10％FBS的α
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MEM培养基；再培养一天后，使用let
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7a mimic转染骨髓间充质干细胞；完成转染后，对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，获得转染miRNA的细胞膜片。5.根据权利要求4所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：使用let
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7a mimic转染骨髓间充质干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨德琴，于洋，陈萌，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：