检测细菌性疫苗的多糖-蛋白结合物原液中游离多糖的量的方法技术

本发明专利技术提供了检测细菌性疫苗的多糖

【技术实现步骤摘要】
检测细菌性疫苗的多糖
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蛋白结合物原液中游离多糖的量的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体而言，涉及检测细菌性疫苗的多糖
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蛋白结合物原液中游离多糖的量的方法。

技术介绍

[0002]游离多糖含量是评价细菌性结合疫苗质量的重要指标之一，游离多糖含量过高时会对在一定程度上削弱疫苗的免疫原性。因此游离多糖含量是结合疫苗研发和生产过程中一项重要的质量控制参数。目前常用的游离多糖含量检测方法有高效液相色谱法、疏水作用层析法、脱氧胆酸钠酸沉淀法(NaDC/HCl法)等。前几种方法对设备要求高，操作复杂且检测时间较长，而NaDC/HCl法简便快捷，不存在上述限制，目前被广泛应用于各类细菌性结合疫苗中游离多糖含量的检测，起到了良好的效果。
[0003]常规法首先通过NaDC在酸性条件下形成胶团并与蛋白质相互作用使其沉淀，再以高速离心的方式使游离多糖与结合物分离，最后用化学方法(例如蒽酮硫酸法)测定结合物中总糖及游离多糖的浓度，进而计算出结合物中游离多糖的百分含量。然而，化学方法存在诸多弊端，例如，其中使用的浓硫酸具有强腐蚀性、强刺激性，不仅对皮肤、粘膜等组织有强烈的刺激和腐蚀作用，还会对水体和土壤造成污染。此外，不同的型别需采用不同的检测方法(糖醛酸法、蒽酮硫酸法、地衣酚法、氧乙酰基法、唾液酸法等)，期间所用的标准品、分光光度计检测波长及计算方法各不相同，试验中需反复使用冰水浴和沸水浴，耗时耗力。

技术实现思路

[0004]为解决上述现有技术中所存在的问题，本专利技术提供了新的检测细菌性疫苗的多糖
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蛋白结合物原液中游离多糖的量的方法。
[0005]具体而言，本专利技术提供了：
[0006](1)一种检测细菌性疫苗的多糖
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蛋白结合物原液中游离多糖的量的方法，其特征在于，包括以下依次进行的步骤：
[0007]1)提供多糖
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蛋白结合物原液，用NaDC/HCl法使所述原液中的游离多糖与所述多糖
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蛋白结合物分离；
[0008]2)用速率比浊法检测所述游离多糖的量。
[0009](2)根据(1)所述的方法，其中步骤2)包括，用所述多糖的特异性抗体与所述游离多糖反应形成抗原
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抗体复合物，检测所述抗原
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抗体复合物的浊度值，由该浊度值得到所述游离多糖的量。
[0010](3)根据(1)所述的方法，其中所述方法还包括，利用添加回收率试验确定所述NaDC/HCl法中使所述原液中的游离多糖与所述多糖
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蛋白结合物分离的HCl浓度。
[0011](4)根据(3)所述的方法，其中所述添加回收率试验包括以下步骤：
[0012]a)提供多糖
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蛋白结合物原液；
[0013]b)提供多糖
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蛋白结合物原液与相同血清型多糖的混合物；
[0014]c)对步骤a)所述多糖
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蛋白结合物原液和步骤b)所述混合物分别用NaDC/HCl法使其中的游离多糖与多糖
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蛋白结合物分离；
[0015]d)在步骤c)之后，用速率比浊法分别检测所述多糖
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蛋白结合物原液中的和所述混合物中的游离多糖的量；
[0016]其中步骤c)在多个不同的HCl浓度下进行。
[0017](5)根据(1)所述的方法，其中步骤1)中所用的多糖
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蛋白结合物原液中的总糖浓度为10
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50μg/mL。
[0018](6)根据(1)所述的方法，其中所述方法还包括，用速率比浊法检测所述原液中的总糖的量。
[0019](7)根据(1)所述的方法，其中所述游离多糖的量为占所述原液中总糖的百分比含量。
[0020](8)根据(1)所述的方法，其中所述多糖
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蛋白结合物原液选自肺炎球菌结合物原液、伤寒Vi结合物原液和脑膜炎球菌结合物原液；所述多糖选自肺炎球菌多糖、伤寒Vi多糖和脑膜炎球菌多糖。
[0021](9)根据(8)所述的方法，其中所述肺炎球菌多糖包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型肺炎球菌多糖；所述脑膜炎球菌多糖包括A、C、Y和W135型脑膜炎球菌多糖。
[0022](10)根据(1)
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(9)任一项所述的方法，其中所述速率比浊法采用速率比浊仪进行。
[0023]本专利技术与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0024]本专利技术打破本领域长期以来的惯性思维，首创性地提出将NaDC/HCl法与速率比浊法结合，利用多糖的特异性抗体，凭借自动化免疫分析系统直接定量结合物原液中的游离多糖而不产生干扰，这样能够快速有效地检测细菌性疫苗的多糖
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蛋白结合物原液中游离多糖的真实含量，为结合疫苗的研发和生产提供保障。具体地，本专利技术的方法具有以下优点：
[0025]1.检测条件简便且效率更高。用NaDC/HCl法沉淀结合物和离心只需在室温下进行，且离心转速较低时间更短，离心后无需吸出上清液，可直接进入速率比浊仪上样，几分钟内可完成检测。然而，常规法需在2
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8℃下操作和离心，且离心要求高的转速和较长的时间，在离心后需要吸出上清液，再按不同的型别加入不同的试剂进行测定，至少4小时才能完成检测。
[0026]2.特异性更强。在速率比浊法中，使用高度特异性的抗体(免疫血清)进行多糖定量，其仅与同型别多糖抗原特异性反应，不与其他型别多糖抗原或杂质交叉反应。而常规法因细菌(例如肺炎球菌)血清型之间的差异干扰，须采用不同的检测方法定量多糖。例如，肺炎球菌1、5型用糖醛酸法，4型用地衣酚法，其余型用蒽酮硫酸法。
[0027]3.自动化程度更高。在速率比浊法中，可保证不同血清型的样品同时检测，而常规法依靠人工取样、加样、煮样、测样，每次只能检测一个血清型的样品。
[0028]4.环保力度更优。在速率比浊法中，缓冲液和洗液均可使用磷酸盐缓冲液，温和无污染，而常规法的浓硫酸具有强腐蚀性、强刺激性及燃爆危险，不仅对皮肤、粘膜等组织有强烈的刺激和腐蚀作用，还会对水体和土壤造成污染。
附图说明
[0029]图1示出本专利技术实施例1中在不同HCl浓度下测得的添加回收率，其中图1A为1、4、5、6A型肺炎球菌多糖的结果，图1B为6B、7F、9V、14型肺炎球菌多糖的结果，图1C为19A、19F、23F型肺炎球菌多糖的结果，图1D为3、18C型肺炎球菌多糖的结果。
[0030]图2示出本专利技术对比例1中用两种方法检测肺炎球菌结合物原液中的游离多糖含量的结果。
具体实施方式
[0031]以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本专利技术作进一步说明，但这并非是对本专利技术的限制，本领域技术人员根据本专利技术的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测细菌性疫苗的多糖
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蛋白结合物原液中游离多糖的量的方法，其特征在于，包括以下依次进行的步骤：1)提供多糖
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蛋白结合物原液，用NaDC/HCl法使所述原液中的游离多糖与所述多糖
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蛋白结合物分离；2)用速率比浊法检测所述游离多糖的量。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)包括，用所述多糖的特异性抗体与所述游离多糖反应形成抗原
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抗体复合物，检测所述抗原
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抗体复合物的浊度值，由该浊度值得到所述游离多糖的量。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括，利用添加回收率试验确定所述NaDC/HCl法中使所述原液中的游离多糖与所述多糖
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蛋白结合物分离的HCl浓度。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述添加回收率试验包括以下步骤：a)提供多糖
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蛋白结合物原液；b)提供多糖
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蛋白结合物原液与相同血清型多糖的混合物；c)对步骤a)所述多糖
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蛋白结合物原液和步骤b)所述混合物分别用NaDC/HCl法使其中的游离多糖与多糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩，任珍芸，李阿妮，罗树权，
申请(专利权)人：兰州生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：