重组PRRSV病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法技术

本发明专利技术通过对GP5

【技术实现步骤摘要】
重组PRRSV病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法
[0001]
：本专利技术属于生物
，涉及重组PRRSV病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法。
[0002]
技术介绍
:猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又称“蓝耳病”，其病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），主要引发妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸障碍，通常表现为仔猪咳嗽、呼吸困难，母猪早产、流产甚至死胎。从20世纪80年代末在北美被发现至今，该病在世界范围内的流行与数次暴发导致了世界各地养猪业的巨大经济损失。
[0003]PRRSV属于动脉炎病毒科，同科的有猴出血热病毒、马动脉炎病毒和促乳酸脱氢酶病毒。而根据最新分类结果显示RRSV被划分到尼多病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arterividae）下的β动脉炎病毒属（Betaarteri virus），同属成员还包括大鼠动脉炎病毒（Rat arteri virus，RatAV）的2个种。随着诊断技术的不断进步，发现PRRSV毒株基因和抗原存在广泛的多样性，总体上把PRRSV划分欧洲型和美洲型，两种型的基因组同源性、抗原性、毒力等方面存在明显的不同，核苷酸水平上的同源性差异在30～45%。又有学者把PRRSV划分为不同的谱系，中国现在流行的主要有：经典PRRSV
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2（谱系5）、高致病性PRRSV（谱系8）、类QYYZ PRRSV
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2（谱系3）以及类NADC30 PRRSV
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2（谱系1）。该病毒于1996年在中国首次分离到，于2006年在国内全面暴发，主要特点为传染性高、体温高、发病率高、死亡率高，直至目前也一直困扰着养猪行业。依据基因特征分为北美型与欧洲型两个亚型，目前我国主要以HP
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PRRS株、NADC30
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like株等北美型PRRSV为主要流行毒株。
[0004]PRRSV的结构基因包括8个开放阅读框，包括ORF2、ORF2a、ORF3~ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，主要编码病毒的功能性蛋白。其中GP2、GP3、GP4、GP5是属于被糖基化修饰的囊膜糖蛋白，而M蛋白、N蛋白、GP2a、GP5a均属于非糖基化囊膜蛋白（未被糖基化修饰）。其中，GP5和M蛋白在病毒粒子中所占的比例比较高是主要的囊膜蛋白（Mokhtar et al. 2016），GP5可产生高水平的中和抗体和细胞免疫（Popescu et al. 2017; Kim et al. 2013）。
[0005]VLPs疫苗是新型基因工程疫苗，将PRRSV中能产生免疫效应的结构蛋白基因重组到表达载体中表达，能准确模拟病毒颗粒抗原的结构。VLPs疫苗不存在遗传物质，免疫效果良好，有望成为预防PRRS的新型疫苗。此类疫苗开发主要难点在于基因序列的选择与优化、表达系统的选择、表达量的提高、VLPs的大规模纯化、如何降低成本、佐剂的选择和添加比例、如何评估疫苗效力等。VLPs疫苗可以刺激产生B淋巴细胞介导反应、CD4
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T细胞增殖反应、细胞毒性体细胞反应。VLPs和B淋巴细胞受体存在交叉联系，能高效识别MHCⅠ类经典途径，以树突状细胞为靶细胞，引起高效的细胞和体液免疫反应。GP5和M蛋白基因重组到大肠杆菌体，表达的蛋白可以引发高效价中和抗体反应和Th1型细胞介导的免疫反应。GP5蛋白表面有A、B两个拮抗表位，A表位削弱中和抗体的产生，对能引起中和效应的B表位有覆盖作用，其次，A表位还先于B表位表现出作用。且研究表明（HP
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PRRSV囊膜蛋白5糖基化位点突变及功能初探），对A表位的氨基酸进行定点突变，对于病毒的复制具有一定的影响，导致病毒
滴度下降，因而，如何减少A表位对B表位的拮抗作用是重组PRRSV病毒样颗粒类疫苗中亟需解决的技术问题，专利技术人与2018年制备得到具有免疫原性的重组PRRSV病毒样颗粒（ZL201811114020.6），然而，在实际生产中仍面临中和抗体滴度产生较晚的问题，仍然存在改进的空间。
[0006]抗原
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抗体复合物疫苗，又称免疫复合物（immune complex, IC）疫苗，是由特异性抗体按照恰当的比例与抗原混合而制成。抗原抗体复合物形成后，抗体分子的Fc片段与抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC）的Fc受体有很高的亲合性，使得与抗体结合的病毒更易更有效地与APC结合，抗原
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抗体复合物被APC吞噬和内化后，即可激活B淋巴细胞和T淋巴细胞，刺激B淋巴细胞成为浆细胞，从而引起强烈的体液免疫和细胞免疫应答。在体外构成的免疫复合物对机体所刺激的体液免疫反应是自然抗原的100倍。此外，Fc受体广泛分布于APC等免疫效应细胞表面，抗体通过与Fc受体结合，能够介导免疫效应细胞对抗原的摄取等作用，参与对抗原诱生的免疫应答调节作用。
[0007]目前，禽病和其他物种疾病的抗原抗体复合物疫苗研究较多，主要有鸡传染性法氏囊IC疫苗、新城疫IC疫苗、马立克IC疫苗、鸡传染性喉气管炎IC疫苗、鸡呼肠病毒IC疫苗、小鹅瘟IC疫苗以及犬细小病毒IC疫苗等。其中，美国罗曼公司研制的鸡法氏囊和新城疫的抗原
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抗体复合物疫苗已获美国农业部批准上市，是目前在世界范围内广泛应用的疫苗之一。然而，关于猪的抗原抗体复合物疫苗少有报道。抗原抗体复合物疫苗也存在着不足之处，例如传统使用血清多克隆抗体与病原相混合制备疫苗的方法受到血清多抗制备的影响，存在制备工序复杂，不同批次间血清抗体含量不稳定，动物来源的血清容易引入外源性的病原污染等缺点，因此具有一定的局限性，而使用单克隆抗体则不存在此类问题。西北农林科技大学南雨辰教授（CN111138535A 一种免疫增强剂及其在疫苗制备中的应用，申请号为CN202010069365.5）制备得到对PRRSV
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I和PRRSV
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II型病毒都具有中和活性的单克隆抗体5D9并将其作为免疫增强剂，所形成的免疫复合物与佐剂联合免疫小鼠时，IFN
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γ分泌T细胞显著升高，提示在灭活病毒免疫过程中，PRRSV特异性抗体5D9与正常的水包油佐剂联合免疫可增强CTL反应。动物试验表明，制备的免疫复合物的免疫保护率相比仅采用商业化佐剂ISA 206制备得到的疫苗以及商品化的弱毒疫苗能够达到更高的保护效力。本专利技术在此基础上，进一步将特异性抗体与PRRSV VLPs进行组合，探索其对动物的保护效力。
[0008]
技术实现思路
：基于目前国内PRRSV疫苗的发展状况，本专利技术旨在提供一种重组PRRSV病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法，通过对GP5和M蛋白进行研究，本专利技术对GP5和M蛋白的基因进行人工改造，采用杆状病毒表达系统进行表达得到了包含GP5
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
免疫复合物以体积计算以46:54比值与Montanide
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞，王晶钰，南雨辰，武春燕，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：