一种磁性微球免疫层析试纸条及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种磁性微球免疫层析试纸条及其制备方法与应用。它是由硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、吸水垫以及聚氯乙烯衬板几部分构成。磁性微球作为标志物用于标记单克隆抗体，抗原类似物和羊抗鼠IgG包被硝酸纤维素膜，分别作为检测线和质控线，制备了磁性微球免疫层析试纸条，对牛奶中的环丙沙星进行检测。磁性微球免疫层析试纸条不仅具有操作步骤少、使用方便、检测速度快的优点，而且还简化了制备方法，降低了成本，提高了灵敏度，为根据磁信号定量分析牛奶中残留的环丙沙星提供了技术支撑。撑。

【技术实现步骤摘要】
一种磁性微球免疫层析试纸条及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于动物性食品中兽药残留快速检测
，特别是涉及一种以磁性微球作为标志物，即时检测牛奶中环丙沙星残留的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。

技术介绍

[0002]氟喹诺酮类抗菌药常用于奶牛疾病的治疗，但这类药物的不规范使用、违规使用禁用药物的现象仍有发生，导致牛奶中的兽药残留超标，对食品安全和人体健康构成威胁。兽药残留超标会污染环境，进而污染农作物和动物饲料；还可能引起人体的过敏反应、毒性作用、体内菌群失衡，直接影响人体健康；此外，兽药残留还会诱导细菌耐药性的出现，增加临床治疗的难度。环丙沙星是恩诺沙星的主要代谢物，快速、灵敏地检测牛奶中的环丙沙星，降低检测成本对于提高奶产品的质量具有重要作用。
[0003]牛奶中环丙沙星残留的检测主要依赖于仪器检测和免疫分析方法。液相色谱、液质联用等分析方法灵敏、准确，但要依赖于昂贵的仪器设备和专业人员，成本较高。相比而言，免疫层析方法的检测速度快、成本低、对设备和人员无特殊要求，因此在即时检测方面有一定优势。
[0004]免疫层析技术是基于抗原
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抗体特异性免疫反应的快速检测技术，根据待测分子的大小可分为夹心法和竞争法，药物小分子一般采用竞争法。层析过程中，标记抗体随样品溶液通过毛细作用在试纸条上移动，与检测线上相应的受体结合聚集，检测线的信号强度反映了样品中待测物的含量。在竞争性免疫层析中，样品中的待测物与检测线上的受体竞争结合抗体，所以一般情况下，检测线的信号强度与待测物含量成反比。同时设质控线，验证检测结果是否有效。
[0005]胶体金是最常见的免疫层析标志物，但灵敏度相对较差。磁性微球的成本低，制备和使用方便，与抗体结合牢固，能够提供光学信号和磁信号两种结果读取方式，满足不同的检测需求。一方面，磁性微球本身呈黑色或棕色，可以作为色彩标签反映硝酸纤维素膜上抗原和抗体的结合情况。另一方面，普通免疫层析通过检测线的颜色强度反映待测物含量，但肉眼或读卡器只能观察记录硝酸纤维素膜表面的颜色信号；如果以磁性微球作为标记材料，整个硝酸纤维素膜上的磁信号都能被收集到；而且，一般牛奶样品中不含磁信号，背景信号低，样本干扰小，所以灵敏度更高。
[0006]因此，以磁性微球作为标志物制备磁性微球免疫层析试纸条，能够提高残留检测方法的灵敏度，缩短时间，节约成本，对于快速、准确地检测牛奶中环丙沙星，确保牛奶和奶产品的安全具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术克服了常规免疫层析方法灵敏度较差的问题，提供一种以磁性微球为标志物、检测牛奶中兽药残留的免疫层析方法，灵敏度高、检测速度快、操作步骤和结果的判定方式简便，对人员和仪器的要求不严格，而且样品不需要经过复杂的前处理。本专利技术的目的
是弥补仪器分析方法在兽药残留检测中步骤繁琐、不适用于现场检测的不足，为即时检测和样本筛选提供途径。
[0008]为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：本专利技术的一个目的在于提供一种磁性微球免疫层析试纸条，其特征在于它是由聚氯乙烯衬板1、硝酸纤维素膜2、结合垫3、样品垫4、吸水垫5几部分组成，上述部件由下到上依次组装，各部件的组装顺序和试纸结构如图1所示。聚氯乙烯衬板位于最底层，硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫依次组装到聚氯乙烯衬板上，衔接处重叠2
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3 mm；其中：硝酸纤维素膜上，检测线用0.8 mg/mL 抗原类似物包被，质控线用0.8 mg/mL羊抗鼠IgG包被，喷涂量均为1 μL/cm，检测线和质控线之间的间隔为4 mm；结合垫用磁性微球标记的单克隆抗体处理，喷涂后干燥；磁性微球免疫层析试纸条的宽度为4 mm；所述的抗原类似物指的是BSA（牛血清白蛋白，下同。市售）与环丙沙星的偶联产物；所述的磁性微球标记的单克隆抗体指的是磁性微球与抗环丙沙星单克隆抗体的偶联产物。
[0009]本专利技术进一步公开了磁性微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）磁性微球标记的单克隆抗体的制备：所用磁性微球的粒径为200 nm，表面带有羧基，取10 mg磁性微球，用0.05 mol/L，pH 5.5的MES缓冲液洗涤三次，随后加入2 mg 1
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(3
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二甲氨基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和5.5 mg N
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羟基琥珀酰亚胺（NHS），混匀，振荡活化15~30 min；活化完成后加入1 mg单克隆抗体，37℃反应2~4 h；用终浓度1%的BSA封闭15~30 min；收集磁性微球标记的单克隆抗体，用含0.03%叠氮化钠0.01 mol/L，pH 7.4的PBS缓冲液，保存；（2）磁性微球标记抗体用BS缓冲液:0.05 M，pH=9.0，含5%蔗糖、2%海藻糖和0.1% PVP）稀释后，均匀分布在结合垫上，冷冻干燥；（3）样品垫用BS缓冲液：0.05 M，pH=9.0，含4%吐温
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20、10%蔗糖、5%海藻糖和0.1%聚乙烯吡咯烷酮处理，37℃条件下烘干；（4）将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫依次组装到聚氯乙烯衬板上，衔接处重叠2
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3 mm，裁切成宽度4 mm的条状，制成磁性微球免疫层析试纸条。
[0010]本专利技术同时也公开了磁性微球免疫层析试纸条在用于牛奶中兽药残留的现场检测和筛选中的应用。主要是定量测定牛奶中残留的环丙沙星、恩诺沙星以及诺氟沙星含量。将磁性微球免疫层析试纸条水平放置，取适量样品溶液，滴加到样品垫位置。反应10~15 min后观察结果。由于样品中的待测物与检测线上的抗原类似物竞争结合抗体，因此，检测线正常显色时，结果为阴性；检测线信号变弱或消失，结果为阳性。无论检测线状态如何，质控线应始终出现信号；若质控线未出现，表示试纸条失效，需要更换试纸条重新检测。
[0011]本专利技术更加详细的描述如下：本专利技术制备的磁性微球免疫层析试纸条由聚氯乙烯衬板、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、吸水垫几部分组成，上述部件由下到上依次组装，衔接处重叠2
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3 mm。其中：硝酸纤维素膜上，检测线用0.8 mg/mL 抗原类似物包被，质控线用0.8 mg/mL羊抗鼠IgG包被，喷涂量均为1 μL/cm，检测线和质控线之间的间隔为4 mm。结合垫用磁性微球标记的单克隆抗体处理，喷涂后干燥。磁性微球免疫层析试纸条的宽度为4 mm。所述的抗原类似物指的是BSA与环丙沙星的偶联产物；羊抗鼠IgG来源市售。
[0012]本专利技术同时也提供了磁性微球免疫层析试纸条的制备方法。磁性微球标记的单克隆抗体的制备：所用磁性微球的粒径为200 nm，表面带有羧基。取10 mg磁性微球，用MES缓冲液（0.05 mol/L，pH 5.5）洗涤三次。随后加入2 mg 1
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，市售）和5.5 mg N
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磁性微球免疫层析试纸条，其特征在于它是由聚氯乙烯衬板（1）、硝酸纤维素膜（2）、结合垫（3）、样品垫（4）、吸水垫（5）几部分组成，上述部件由下到上依次组装，聚氯乙烯衬板位于最底层，硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫依次组装到聚氯乙烯衬板上，衔接处重叠2
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3 mm；其中：硝酸纤维素膜上，检测线用0.8 mg/mL 抗原类似物包被，质控线用0.8 mg/mL羊抗鼠IgG包被，喷涂量均为1 μL/cm，检测线和质控线之间的间隔为4 mm；结合垫用磁性微球标记的单克隆抗体处理，喷涂后干燥；磁性微球免疫层析试纸条的宽度为4 mm；所述的抗原类似物指的是BSA与环丙沙星的偶联产物；所述的磁性微球标记的单克隆抗体指的是磁性微球与抗环丙沙星单克隆抗体的偶联产物。2.权利要求1所述磁性微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）磁性微球标记的单克隆抗体的制备：所用磁性微球的粒径为200 nm，表面带有羧基，取10 mg磁性微球，用0.05 mol/L，pH 5.5的MES缓冲液洗涤三次，随后加入2 mg 1
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二甲氨基丙基)

【专利技术属性】
技术研发人员：李存，刘畅，杨琳燕，李道稳，李留安，张伟，马毅，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：