一种铁皮石斛盐诱导型启动子proDoMYB75及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种铁皮石斛盐诱导型启动子proDoMYB75及应用。所述的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，或为具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有75％以上同源性且同样具有启动功能的DNA分子。本发明专利技术的铁皮石斛高盐诱导型启动子proDoMYB75能够特异地驱动外源基因在高盐诱导条件下在拟南芥的不同组织中表达，如叶和茎等，这对提高和改善植物的生长特性，尤其是改善植株的耐高盐性能具有重要的实践价值，对有效改良植物耐高盐性状具有重要的指导意义。性状具有重要的指导意义。性状具有重要的指导意义。

【技术实现步骤摘要】
一种铁皮石斛盐诱导型启动子proDoMYB75及应用

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[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种铁皮石斛盐诱导型的启动子proDoMYB75及其应用。

技术介绍
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[0002]在自然环境中，植物可能面对不利的环境条件，比如干旱、盐分胁迫、极端天气等不利的环境因子，造成植物生长发育的滞后、产量降低，甚至造成植物死亡。其中土壤盐碱化被认为是制约全球农作物产量和品质的关键因子，盐胁迫导致渗透胁迫、离子失衡，离子中毒和活性氧损害等复杂的植物生理和代谢的影响(Parida et al.2005)。
[0003]植物为了应对盐胁迫进化出各种响应机制以降低盐胁迫对自身的伤害。比如植物改变多种代谢途径，包括生产兼容性溶质以维持蛋白稳定、细胞结构和细胞渗透压。比如氨基酸中的脯氨酸，小分子糖如葡萄糖、果糖、蔗糖和果聚糖都可以作为渗透调节物质(Krasensky et al.2012)。此外，一些抗氧化物质如黄酮类物质促进植物体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的清除。细胞对胁迫的应对策列包括调节膜系统、改变细胞壁结构和改变细胞周期及细胞分裂。
[0004]基因的表达调控参与植物的生长、发育以及各种环境的适应，启动子是启动和调节相关基因转录的顺式作用DNA片段，对基因的表达起到关键的作用。启动子含有两个重要区域，分别为RNA聚合酶II结合并启动基础水平转录的核心区域和包含多个顺式调控基序的远端区域，对基因的时空表达进行调控(Mithra et al.2017)。TATA/>‑
box是第一个被识别的真核核心启动子基序，位于转录起始位点(transcription start site，TSS)上游的约30bp处(Fickett and Hatzigeorgiou 1997)。增强子和沉默子则是启动子远端调控元件，可显著提高或抑制基因的转录水平。根据启动子对基因表达控制的性质，这些调控元件可分为组成型启动子(constitutive promoter)、组织特异性异性启动子(tissue specific promoter)，以及诱导型启动子(inducible promoter)。诱导启动子是指在某些环境因子的作用下，通过外部控制对相关基因提供精确的表达调控的启动子，它们有广泛的潜在应用。

技术实现思路
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[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种铁皮石斛盐诱导型的启动子proDoMYB75，解决现有技术中的高盐环境引起植物生长发育异常、减产的问题。
[0006]本专利技术的专利技术人对植物耐盐性方面进行研究，并发现了驱动外源基因在高盐诱导条件下表达的启动子。
[0007]本专利技术的目的在于提供一种盐诱导型启动子，可使外源目的基因在高盐诱导下提高表达水平，对于植物在盐份适宜时的生长发育没有不利影响，具有非常重要的应用潜力。
[0008]本专利技术的铁皮石斛高盐诱导型的启动子proDoMYB75，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，或为具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有75％以上同源性且同样具有启动功能的DNA分子。
[0009]本专利技术首次发现、定位一个新的铁皮石斛高盐诱导型启动子proDoMYB75。本专利技术的高盐诱导型启动子proDoMYB75可以启动相关目的基因的表达，可以培育耐盐植物品种，可以应用于植物遗传改良，对植物盐胁迫的调控机制研究也具有重要意义。
[0010]因此，本专利技术的第二个目的是提供启动子proDoMYB75在启动目的基因表达中的应用。
[0011]优选，启动子proDoMYB75在盐诱导下启动目的基因表达中的应用。
[0012]本专利技术的第三个目的是提供启动子proDoMYB75培育耐盐植物品种中的应用。
[0013]所述的植物可以为铁皮石斛或拟南芥等植物。
[0014]本专利技术的铁皮石斛高盐诱导型启动子proDoMYB75能够特异地驱动外源基因在高盐诱导条件下在拟南芥的不同组织中表达，如叶和茎等，这对提高和改善植物的生长特性，尤其是改善植株的耐高盐性能具有重要的实践价值，对有效改良植物耐高盐性状具有重要的指导意义。
附图说明：
[0015]图1是qPCR分析铁皮石斛DoMYB75在盐胁迫(250mM NaCl)的表达。
[0016]图2是proDoMYB75的PCR产物电泳图。M：DNA marker，1：proDoMYB75片段。
[0017]图3是proDoMYB75::GUS转基因株系在盐胁迫下的GUS染色。一周大的小苗，胁迫处理24小时后进行GUS染色。
具体实施方式：
[0018]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0019]实施例1
[0020]1材料
[0021]1.1植物材料
[0022]铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)组培苗，生长在1/2MS+质量分数0.1％活性炭+质量分数2％蔗糖+质量分数0.6％琼脂粉(pH 5.4)的培养基上,组培室条件为24
±
2℃、12小时光照。
[0023]2.方法
[0024]2.1铁皮石斛基因组DNA的提取
[0025]取铁皮石斛小苗液氮中研磨成粉状，转至2mL离心管中，加入700μL预热(65℃)的2
×
CTAB提取液，充分混匀，混合液于65℃水浴15min，每隔5min摇一次。取出混合液室温冷却，再加入等体积酚氯仿，振荡混匀，12000r/min离心15min。取上清，加入700μL氯仿再抽提一次，上清转至一新1.5mL离心管，加入0.6倍体积异丙醇，振荡混匀，于
‑
20℃冰箱放置10min，12000r/min离心10min。弃上清，加入70％乙醇500μL，洗涤DNA沉淀两次，12000r/min离心30sec，用枪头进来吸干离心管中的酒精。室温晾5min，加入100μL 1
×
TE(含RNase A，20μg/mL)溶解DNA，37℃反应30min，以除去RNA。
[0026]取2μL DNA溶解液作琼脂糖凝胶电泳检测，余下放置
‑
20℃冰箱保存备用。
[0027]2.2启动子proDoMYB75的克隆
[0028]本专利技术利用巢式PCR技术克隆启动子proDoMYB75序列。利用铁皮石斛全基因组测
序结果设计两对引物PCR(F1:CATTGCTACCTGTAGGTTCC,R1：GAATTCGTGCAGTTTCAAGG；F2:CGATGTGGAACCAACATCCG,R2：TGAGAGGTTAGCAGAGGACC)，以铁皮石斛基因组DNA为模板，进行巢室PCR扩增。所用的酶为东洋彷高保真DNA聚合酶试剂盒(KOD FX)，具体操作参见说明书。第一次扩增的PCR产物稀释50倍本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种启动子proDoMYB75，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，或为具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有75％以上同源性且同样具有启动功能的DNA分子。2.权利要求1所述的启动子proDoMYB...

【专利技术属性】
技术研发人员：何春梅，段俊，张明泽，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：