一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于人呼吸道病原体生物检测技术领域，公开了一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。该试剂盒引物是由感染人呼吸道7种型别腺病毒高保守区设计。实现了单管单重PCR即可同时检测感染人呼吸道的7种型别腺病毒，且不会受其它感染人类肠道腺病毒型别及其它微生物序列影响，保证高覆盖度、高灵敏性、高特异性和高准确性。对上述7种型别腺病毒建立进化树模型及亲缘关系分析，进行待检片段特异性和敏感性评估后，挑选五联体蛋白对应基因序列作引物结合位点。本试剂盒覆盖型别广，利用熔解曲线染料法，使检测效率、特异性、敏感性、经济型、便捷性，相比于常规的单管多重或多管单重检测显著提高。或多管单重检测显著提高。或多管单重检测显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒


[0001]本专利技术属于人呼吸道病原体生物检测
，具体涉及一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。

技术介绍

[0002]急性上呼吸道感染、急性气管/支气管炎、支气管扩张/肺炎等是呼吸道感染的常见病，其临床表现各有不同。呼吸道感染的病原体种类较多，一种临床表现可由多个病原体引起，同时一个病原体也可造成多种临床表现。因不能及时发现病原体，致使患者病情延误或加重，同时也加重了抗生素的滥用。因此，及时、快速地对患者血清进行病原体检测，及早明确病原体，对临床诊断、治疗及抗生素的规范使用有着重要的意义。
[0003]近年来，人腺病毒(HAdV)感染引起呼吸道传染病时有发生，不仅对相关人群的健康造成严重危害，也为其家庭带来了巨大经济损失。人感染HAdV后可出现流感样症状，且该病毒传染性较强，对处于持续密集接触场所的特定群体如军营、学校等人员的影响较大。
[0004]HAdV属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，是一种无包膜的双链DNA病毒。其衣壳呈二十面体对称，由252个壳粒组成，其中240个为六联体，另12个为五联体基底，每个五联体基底上结合着1根纤突蛋白。不同型别的基因组长度范围在26～45kb。
[0005]人腺病毒可分为多种型别，引起呼吸道疾病，也可感染消化道、泌尿道、眼部、心肌等部位而引起疾病。感染呼吸道的主要包括HAdV
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B、HAdV
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C和HAdV
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E组，是呼吸道感染的重要病原之一。
[0006]我国北部、西北部和南部地区的优势流行株属于HAdV
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B组，以3型和7型为主；而我国东部地区的优势流行株属于HAdV
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C组，主要是1型、2型和5型；同时我国南方和北方近年多地均局部发生新型55型感染流行。
[0007]腺病毒的传统分型方法主要为血清学分型方法。该种分型方法受限于病毒分离培养耗时长且操作要求严格，一般实验室难以开展，同时对细胞病变的观察受操作人员的主观影响较大，结果可靠性不强。此外，当病毒毒株滴度很低时，也无法进行完整的血清学试验，从而给分型造成困难。
[0008]随着分子生物学技术的发展，出现了通过PCR扩增和基因测序等分子生物学技术来进行鉴定的方法。上述方法受限于腺病毒的型别众多，我国地域辽阔，不同地区流行的HAdV的优势基因型不同。重组导致的突变会使得为特定区域流行的几个腺病毒型别设计的荧光定量PCR的引物及探针，在其它地域流行的不同型别腺病毒的序列不匹配，检测易造成“脱靶”、“假阴性”，进而导致误诊、漏诊状况。
[0009]由于腺病毒重组率很高，不同型别间保守区域过于狭窄，倘若按照传统方案采用一个型别使用一对引物及一条Taqman探针，这就意味着为了覆盖7个型别，就需要在单管中实现7对引物及7条Taqman探针的7重PCR，一方面造成对单一型别检测的灵敏度下降，另一方面也使得试剂成本成倍提高。

技术实现思路

[0010]为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。
[0011]本专利技术所采用的技术方案为：一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括腺病毒检测液、内参基因检测液、扩增反应液、阴性对照品、阳性对照品、内参质控品和无核酶水；
[0012]所述腺病毒检测液包括针对人呼吸道腺病毒的特异性引物对，特异性引物对包括第一引物、第二引物、第三引物或第四引物中的一种，第一引物包括第一特异性上游引物和第一特异性下游引物，第二引物包括第二特异性上游引物和第二特异性下游引物，第三引物包括第三特异性上游引物和第三特异性下游引物，第四引物包括第四特异性上游引物和第四特异性下游引物，上述各引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.8所示；优选为第一引物；
[0013]所述人呼吸道腺病毒的特异性引物对的结合位点为人腺病毒五联体蛋白所对应的基因序列。
[0014]作为优选地，所述内参基因检测液包括针对内参基因的内参引物对，所述内参引物对包括内参上游引物和内参下游引物的核苷酸序列，如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。
[0015]作为优选地，所述腺病毒检测液中的内参基因为人核糖核酸酶P基因。
[0016]作为优选地，所述腺病毒检测液的引物浓度均为4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、15μM、18μM和20μM中的任意一种。
[0017]作为优选地，所述腺病毒检测液的引物浓度为15μM。
[0018]作为优选地，所述扩增反应液包括含热启动的DNA聚合酶、dNTPs、dsDNA染料、PCR扩增缓冲液、Mg
2+
、UNG酶和dUTP。
[0019]作为优选地，荧光定量检测试剂盒的检测方法为染料法，该染料结合于PCR反应产物的双链小沟区域。
[0020]作为优选地，所述阴性对照品为生理盐水。
[0021]作为优选地，所述阳性对照品为呼吸道腺病毒五联体蛋白基因序列的工程菌悬液。
[0022]作为优选地，所述内参质控品为人核糖核酸酶P基因序列的工程菌悬液。
[0023]本专利技术的有益效果为：
[0024](一)、本专利技术提供了一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒中含有设计的腺病毒检测液特异性引物，是由感染人呼吸道的7种型别腺病毒(1、2、3、4、5、7、55)的高保守区设计而来。该试剂盒中利用挑选出来的、针对人呼吸道腺病毒的特异性引物对，为正反各一条引物构成，单管扩增用于检测样本中呼吸道腺病毒，其PCR产物为单一条带；内参基因的引物，为正反各一条引物构成，单管扩增用于检测样本中人源DNA，防止样本采集错误或检测失败造成的“假阴性”，其PCR产物为单一条带。
[0025]该试剂盒实现了单管单重PCR即可同时检测感染人呼吸道的7种型别腺病毒，且不会受到其它感染人类肠道的腺病毒型别，如40型、41型，以及其它微生物的序列的影响，保证了检测的高覆盖度、高灵敏性、高特异性和高准确性，解决了目前检测环节为了覆盖多个
型别而采用多组引物或多重PCR等技术而造成覆盖度、灵敏性、特异性、经济性不能均优的难点问题。
[0026](二)、本申请中试剂盒的设计，是对上述7种型别腺病毒建立进化树模型及亲缘关系分析，并进行了待检片段特异性和敏感性评估后，对全基因组数十万碱基序列进行全面比对，找到数十个同源区域，并根据引物设计的多种原则，最终依靠在实验中检测了扩增效能等参数的多轮选择，挑选了五联体蛋白所对应的基因序列作为引物的结合位点。由于本检测试剂盒所覆盖的型别广，基因序列差异过大，引物有效的结合区域短小，遂在此基础上设计开发了基于熔解曲线染料法的检测方案，该方案使检测效率、特异性、敏感性、经济型、便捷性，相比于常规的单管多重或多管单重的检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括腺病毒检测液、内参基因检测液、扩增反应液、阴性对照品、阳性对照品、内参质控品和无核酶水；所述腺病毒检测液包括针对人呼吸道腺病毒的特异性引物对，特异性引物对包括第一引物、第二引物、第三引物或第四引物中的一种，第一引物包括第一特异性上游引物和第一特异性下游引物，第二引物包括第二特异性上游引物和第二特异性下游引物，第三引物包括第三特异性上游引物和第三特异性下游引物，第四引物包括第四特异性上游引物和第四特异性下游引物，上述各引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.8所示；优选为第一引物；所述人呼吸道腺病毒的特异性引物对的结合位点为人腺病毒五联体蛋白所对应的基因序列。2.根据权利要求1所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因检测液包括针对内参基因的内参引物对，所述内参引物对包括内参上游引物和内参下游引物的核苷酸序列，如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。3.根据权利要求1所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述腺病毒检测液中的内参基因为人核糖核酸酶P基因。4.根据权利要求1所述的一种同时检...

【专利技术属性】
技术研发人员：景寅，张梦，赵立明，
申请(专利权)人：北京华瑞康源生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：