一种高效的因子分泌型NK细胞扩增方法及其应用技术

一种高效的因子分泌型NK细胞扩增方法及其应用，涉及一种因子分泌型NK细胞扩增方法及其应用，尤其涉及CD56

【技术实现步骤摘要】
一种高效的因子分泌型NK细胞扩增方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种因子分泌型NK细胞扩增方法及其应用，尤其涉及CD56
bright NK细胞扩增方法及其应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤(Natural killer,NK)细胞是一类重要的淋巴细胞，是人类固有免疫的首道天然防线。由于其在异种移植免疫、控制肿瘤生长及病毒感染中具有重要作用，近年来在生物技术和细胞药物研究领域越来越受到重视。依据CD56分子表达水平不同，NK细胞可以分为CD56
bright NK、CD56
dim NK细胞和CD56
neg
3个亚群，健康人外周血中，CD56
dim
NK细胞占外周血NK细胞的90％，以杀伤功能为主，CD56
bright NK细胞占外周血NK细胞的10％，以分泌细胞因子为主，不存在或仅存在极少量CD56
neg
NK，且其杀伤功能与因子分泌能力均较弱。
[0003]Chan A等研究表明，在一定条件下CD56
bright NK细胞可以分化成为CD56
dim
NK细胞。曹雪涛的《免疫学前沿进展》中报道，CD56
bright NK细胞在外周血中仅约占NK细胞的10％，但在淋巴结、肿瘤组织边缘、肺结核胸腔积液、肠道、子宫等天然免疫场所中的比例明显高于CD56
dim NK细胞亚群，说明CD56
bright NK细胞于发生感染或异常组织中存在较高，可能对此类疾病预后有一定的作用。
[0004]CD56
bright NK细胞具有一定的杀伤能力以及较强的细胞因子分泌能力，其可分泌γ干扰素(interferon，IFN
‑
γ)、白介素10(interleukin，IL
‑
10)、白介素13(interleukin，IL
‑
13)，巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony stimulating factor，GM
‑
CSF)等。IFN
‑
γ具有抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节三大功能，可以进行免疫调节及验证调节，能够对免疫系统疾病及细菌、真菌、病毒或寄生虫等感染疾病起到较好的治疗效果；IL
‑
13和IL
‑
10分别可以通过调节单核细胞和巨噬细胞功能来进行炎症控制，抑制炎性因子的释放，如TNF、IL
‑
6、IL
‑
1等；GM
‑
CSF可作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，进而起到预防和治疗肿瘤放、化疗后引起的白细胞减少，治疗骨髓造血功能障碍与骨髓增生异常综合征以及加快恢复感染所引起的中性粒细胞减少等作用。同时，CD56
bright NK细胞表面表达CCR7、CD62L、CXCR3等趋化因子受体，故其可以在次级淋巴结或炎症部位富集，起到炎症调节作用。
[0005]然而，由于CD56
bright NK在NK细胞中占比较低，因而分选后基数较低，较难扩增出要求的细胞数量，但若不进行分选则获得CD56
bright NK的细胞纯度较低，也难以满足需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术是要解决现有方法扩增CD56
bright NK细胞的数量和纯度较低的问题，提供一种高效的因子分泌型NK细胞扩增方法及其应用。
[0007]本专利技术高效的因子分泌型NK细胞扩增方法，包括以下步骤：
[0008]步骤一：分离脐血或外周血中单个核细胞；
[0009]步骤二：采用分选型流式细胞仪对单个核细胞进行分选，筛选范围为Q1区域最上
部的5％，即得到CD56强阳性细胞；
[0010]步骤三：对步骤二获得的CD56强阳性细胞进行培养，培养条件为37℃且5％CO2饱和湿度；具体方法为：将CD56强阳性细胞接种于装有无血清培养基A的T25瓶中培养，培养至第3d时收集细胞，并补入无血清培养基A继续培养；在培养至第5d时将细胞转移至T75培养瓶中，补充无血清培养基A；之后每隔2d进行补液，所补液体为含IL
‑
2、IL
‑
15和IL
‑
21的GT
‑
T551 H3无血清培养基；培养至第15d，即完成CD56
bright NK细胞的扩增；步骤三所述无血清培养基A为含IL
‑
2、IL
‑
15、IL
‑
21和硫酸葡萄糖的GT
‑
T551 H3无血清培养基。
[0011]上述方法扩增得到的CD56
bright NK细胞在制备治疗抗炎药物中的应用。
[0012]本专利技术的有益果：
[0013]1、本专利技术通过细胞流式对脐血或者外周血中CD56强阳性细胞进行分选，保证起始细胞即为较纯的CD56
bright
NK细胞，此过程可有效的去除了T细胞、B细胞、单核细胞和CD56
dim
NK细胞等，为后续CD56
bright
NK细胞扩增的纯度提供保证。
[0014]2、本专利技术在进行NK细胞培养时，加入生长因子IL
‑
2、IL
‑
15和IL
‑
21对分选的特定亚群NK细胞进行诱导扩增，操作简单，不引入动物源成分，安全性更高。三种因子配合能够更好的激活NK细胞的增殖、维持其长期生长、增强其毒性及分泌功能，进而提高其扩增数量及保证其纯度与功能。
[0015]3、由于分选后可获得的CD56
bright
NK细胞数量较少，一般80
‑
100mL全血可获得1
×
106个种子细胞，因此需要保证低密度下，细胞能够高效存活与扩增。本专利技术在细胞培养过程中加入硫酸葡萄糖，硫酸葡萄糖为天然阳离子物质，对细胞无毒性，其可以有效促使细胞均匀聚集，加强细胞间的联系和细胞分泌产生的互相作用，有效保证扩增出细胞的均一性，且能够达到更高的细胞数量。
[0016]4、采用本专利技术的方法，培养15天即使细胞扩增约6000倍，且CD3
‑
CD56+细胞占总细胞比例可达90％以上，其中CD56
bright
NK细胞占NK细胞的85％以上。本专利技术所获得的CD56
bright
NK细胞纯度和数量均较高。
[0017]5、本专利技术获得的CD56
bright
NK细胞较高比例的表达趋化受体，并且具有较高的抗炎因子的分泌能力，其可能与扩增出的CD56
bright
NK细胞纯度有关，此特点为其在抗炎应用提供可能性。
附图说明
[0018]图1为PBMCs同型对照的细胞流式图；
[0019]图2为PBMCs中NK细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效的因子分泌型NK细胞扩增方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤一：分离脐血或外周血中单个核细胞；步骤二：采用分选型流式细胞仪对单个核细胞进行分选，筛选范围为Q1区域最上部的5％，即得到CD56强阳性细胞；步骤三：对步骤二获得的CD56强阳性细胞进行培养，培养条件为37℃且5％CO2饱和湿度；具体方法为：将CD56强阳性细胞接种于装有无血清培养基A的T25瓶中培养，培养至第3d时收集细胞，并补入无血清培养基A继续培养；在培养至第5d时将细胞转移至T75培养瓶中，补充无血清培养基A；之后每隔2d进行补液，所补液体为含IL
‑
2、IL
‑
15和IL
‑
21的GT
‑
T551 H3无血清培养基；培养至第15d，即完成CD56
bright NK细胞的扩增；步骤三所述无血清培养基A为含IL
‑
2、IL
‑
15、IL
‑
21和硫酸葡萄糖的GT
‑
T551 H3无血清培养基。2.根据权利要求1所述的一种高效的因子分泌型NK细胞扩增方法，其特征在于步骤一中分离脐血或外周血中单个核细胞的方法为：取一份脐血或外周血，于离心管中离心，去除上层浅黄色血浆后，用生理盐水补到血浆原有的体积，再取新的离心管，加入淋巴细胞分离液，并将稀释的血液加入到淋巴细胞分离液中，稀释的血液与淋巴细胞分离液有分层，离心，下层为红细胞，中间的白膜层为单个核细胞，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春香，张怡，吕秀明，刘艳青，
申请(专利权)人：天晴干细胞股份有限公司，
类型：发明
国别省市：